зачем нужны праймеры в репликации
Праймер (молекулярная биология)
Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты или связана молекула, служит исходным пунктом репликации ДНК. Праймер нужен потому, что ни одна ДНК-полимераза (фермент, который катализирует репликацию ДНК) не может начать синтез новой молекулы ДНК с одноцепочечной матрице, поскольку нужна двухцепочечная участок для присоединения к ДНК, а также они способны только присоединять нуклеотид к уже имеющейся — ОН группы на 3 ‘конце другого нуклеотида.
Репликация ДНК
В естественной репликации ДНК, в качестве праймеров используются короткие цепочки РНК длиной около 12 нуклеотидов, синтезируются ферментомпраймазою. Праймазой может присоединять как рибонулеотиды, так и дезоксирибонуклеотидов, но синтезирует именно фрагмент РНК, поскольку рибонуклеотидов в ядре больше. Эти молекулы РНК позже изымаются и заменяются на ДНК ДНК-полимеразы.
Искусственные праймеры
Многие лабораторных методов биохимии и молекулярной биологии, привлекают использования ДНК-полимеразы, например секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют праймеров. Праймеры, используемые в этих методах, обычно короткие, химически синтезированные молекулы ДНК длиной 20-30 оснований.
Для ПЦР используют 2 праймеры, которые ограничивают с двух сторон последовательность, размножается. Для повышения специфичности реакции выбирают праймеры длиной 20-30 нуклеотидов, с содержанием Г-Ц пар около 50-60%. Г-Ц пары соединены между собой тремя водородными связями, поэтому они гарантируют лучший и более выборочный связь между праймером и матрицей. Для того, чтобы последовательность праймеров была уникальная и связывалась только с одной матрицей в смеси разных молекул ДНК (например, смесь всех ДНК человека), существуют специальные программы, которые с помощью баз последовательностей ДНК подбирают нужную последовательность нуклеотидов праймера.
Для клонирования последовательностей ДНК часто в последовательности праймеров вводят дополнительные нуклеотиды — сайты рестрикции, по которым режут ферменты рестриктазы. После приумножение нужного участка ДНК в ПЦР, полученные молекулы смешивают с ферментом, который разрезает их, образуя на концах так называемые «липкие концы». Такие конце позволяют легко вставить продукт ПЦР к искусственному ДНК-вектора.
Праймеры
Праймер (primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут только наращивать существующую цепь. Полимеразы начинают репликацию с 3′-конца праймера, и создают копию другой цепи.
В большинстве случаев естественной репликации ДНК, праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой, и впоследствие заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющией в норме функции репарации.
Многие лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, которые предполагают использование ДНК-полимеразы, такие, как секвенирование или полимеразная цепная реакция, требуют наличие праймеров. Такие праймеры обычно короткие, химически синтезированные олигонуклеотиды, длиной порядка двадцати оснований. Они гибридизуются с ДНК-мишенью, которая затем копируется полимеразой.
См. также
Смотреть что такое «Праймеры» в других словарях:
Праймеры — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, комплиментарные соответствующим участкам ДНК мишени. Источник: ПОРЯДОК И ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТРОЛЯ ЗА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИЕЙ, ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ/ИЛИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И … Официальная терминология
Праймеры — 13. Праймеры искусственно синтезируемые короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные определенному участку искомой ДНК, используемые в полимеразной цепной реакции. Источник … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации
Феромоны-праймеры — Феромоны, вызывающие долговременный физиологический эффект или физиологические изменения преимущественно гормонального характера в организме реципиента, например, влияющие на эстральный цикл особей женского пола. Также называются прайминг… … Психология ощущений: глоссарий
Полимеразная цепная реакция — (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо амплификации ДНК, ПЦР… … Википедия
ДНК-маркер — Рис.1 Электрофорез ПЦР продуктов в агарозном геле и окрашенных бромистым этидием, полученных методом IRAP амплификации. Левая дорожка ДНК известной длины (от 900 до 3000 пар нуклеотидов) … Википедия
ПЦР — Запрос «ПЦР» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой… … Википедия
Полимеразная цепная — Запрос «ПЦР» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой… … Википедия
ДНК-полимераза — Трёхмерная структура ДНК связывающих спирально шпилечных участков в человеческой бета ДНК полимеразе ДНК полимераза фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализир … Википедия
ДНК-зависимая ДНК-полимераза — Трехмерная структура ДНК связывающих спирально шпилечных участков в человеческой бета ДНК полимеразе ДНК полимераза фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки… … Википедия
ДНК-полимеразы — Трехмерная структура ДНК связывающих спирально шпилечных участков в человеческой бета ДНК полимеразе ДНК полимераза фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки… … Википедия
Праймер
Примечания
См. также
Полезное
Смотреть что такое «Праймер» в других словарях:
праймер — сущ., кол во синонимов: 1 • феромон (16) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов
ПРАЙМЕР — (англ. primer), феромон, действие которого проявляется не сразу, а через определенный и необходимый промежуток времени (например, “царское вещество” пчел). Экологический энциклопедический словарь. Кишинев: Главная редакция Молдавской советской… … Экологический словарь
праймер — Короткая последовательность молекулы ДНК, использующаяся для инициации синтеза специфического фрагмента при полимеразной цепной реакции [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN primer … Справочник технического переводчика
Праймер — специальный дисперсионный лак, при помощи которого покрывают запечатанные слои обычных (традиционных) масляных офсетных красок, если предполагается нанести на слой этих красок слой УФ лака. П. служит буфером и разделяет слой краски от слоя лака,… … Реклама и полиграфия
праймер — poklijai statusas T sritis chemija apibrėžtis Suklijavimą gerinantis gruntas. atitikmenys: angl. primer rus. адгезионный грунт; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймер — pradmuo statusas T sritis chemija apibrėžtis Oligomeras, įeinantis į biopolimero sudėtį ir būtinas jo sintezei. atitikmenys: angl. primer rus. затравка; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймеріз — множинний іменник первинні вибори партійних кандидатів у США … Орфографічний словник української мови
Праймер произвольный — * праймер адвольны * arbitrary primer короткий олигонуклеотидный праймер, используемый в определенных ПЦР методах для инициации синтеза ДНК в случайных (произвольных) участках взятой для эксперимента ДНК мишени … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер затравка — Праймер, затравка * праймер, затраўка * primer короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК. К его 31 OH концу ДНК полимераза (см.) может добавлять нуклеотиды в растущую цепь ДНК в 51 31… … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер битумно-полимерный — ТЕХНОНИКОЛЬ № 03 (ТУ 5775 042 17925162 2006) – однокомпонентный материал холодного применения. Предназначен для обработки поверхности стальной ортотропной плиты и железобетонной плиты пролетных строений мостовых сооружений перед укладкой… … Энциклопедия терминов, определений и пояснений строительных материалов
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.
Значение слова «праймер»
В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой (праймаза у прокариот, ДНК-полимераза у эукариот), и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющий в норме функции репарации.
Многие лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, которые предполагают использование ДНК-полимеразы, такие, как секвенирование или полимеразная цепная реакция, требуют наличие коротких олигонуклеотидов (праймеров). Такие праймеры обычно длиной от 6 до 50 оснований, химически синтезированные олигонуклеотиды.
пра́ймер
1. генет. короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, служащий затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы (при репликации ДНК) ◆ Первичная транскрипция с образованием мРНК инициируется гуанинтерминированным праймером, имеющим клеточное происхождение… А. E. Деконенко, E. А. Ткаченко, «Хантавирусы и хантавирусные инфекции», 2004 г. // «Вопросы вирусологии» (цитата из НКРЯ)
2. космет. жидкий крем которым заполняют поры и морщины создавая идеально ровную базу под мэйкап ◆ Прежде чем нанести подводку (или любое средство для глаз, если уже на то пошло), я всегда использую праймер. В течение дня мои веки становятся жирными, мейкап растекается. Праймер закрепляет косметику для глаз на весь день. Дженнифер Скотт, «Уроки мадам Шик. 20 секретов стиля, которые я узнала, пока жила в Париже» / перевод Ирины Крупичевой, 2017 г. (цитата из библиотеки Google Книги)
Делаем Карту слов лучше вместе
Привет! Меня зовут Лампобот, я компьютерная программа, которая помогает делать Карту слов. Я отлично умею считать, но пока плохо понимаю, как устроен ваш мир. Помоги мне разобраться!
Спасибо! Я стал чуточку лучше понимать мир эмоций.
Вопрос: магнитик — это что-то нейтральное, положительное или отрицательное?