зачем нужны кристы в митохондриях

Зачем нужны кристы в митохондриях

Библиографическая ссылка:
Косарев А.В. Митохондрия как биологический тепловой двигатель внутри клеточного конвейера // Портал научно-практических публикаций [Электронный ресурс]. URL: https://portalnp.snauka.ru/2014/07/8911 (дата обращения: 13.11.2021)

АННОТАЦИЯ

Рассмотрены морфологические и физиологические особенности клеточной органеллы митохондрии. Митохондрии являются “энергетическими станциями клетки”, участвуют в процессах клеточного дыхания и преобразуют порядка 40% энергии окисления субстратов в АТФ, в форму энергии доступную при использовании в многочисленных клеточных процессах. Принято считать, что остальные 60% выделившейся при окислении энергии превращаются в тепло и выводятся из клетки и организма. В статье высказано предположение, что, митохондрия использует энергию окисления более рационально, чем принято считать. 40% используется в процессе фосфорилирования АТФ, а 60%, выделяясь в объёме матрикса митохондрии, вызывают местный подъём температуры и как следствие давления. Повышенное давление в области матрикса сдавливает кристы и митохондрия работает как сильфонный насос. Биологический раствор выдавливается в форме гидродинамического потока из межмембранного пространства и матрикса митохондрии, обеспечивая все внутриклеточные перемещения.

Все живые организмы вне зависимости от их сложности имеют в своей основе клеточное строение. Однако “даже в случае простейшей клетки в процесс метаболизма вовлечены несколько тысяч сопряжённых химических реакций, что, безусловно, требует тонких механизмов координации и регуляции. Иными словами, здесь требуется чрезвычайно сложная функциональная организация. Если рассмотреть, как клетка выполняет сложную последовательность операций, то можно заметить, что клетка работает по тем же принципам, что и современный сборочный конвейер”. [9].

Основным источником энергии, функциональную основу жизни представляют циклические ферментативные реакции окисления и синтеза. Именно в силу цикличности этих реакций поддерживается постоянство неравновесности живой системы, формируются градиенты температур и давлений. Согласно синергетике и теории диссипативных структур наличие градиентов – необходимое условие для формирования в системе кооперативных потоков. Как пишет автор [10]: “Весьма вероятно, что через созидание диссипативных структур возникла жизнь”. К тому же на стадии окисления до 40% выделившейся энергии связывается в универсальном энергоносителе АТФ в удобный для живого вид потенциальной энергии, используемый во многих активных процессах.

Транспорт веществ внутри клетки и во всём организме обеспечивается кооперативными потоками энергии, продуцируемыми в клетках, т.к. только такие потоки способны совершать работу против сил диссипации, совершать внешнюю работу. В животной клетке действует своеобразный двигатель внутреннего сгорания, преобразующий энергию химических связей в механическую энергию гидродинамических потоков биологического раствора. Особенностью биологического двигателя является то, что производство механической работы в биоцикле сопряжено с синтезом высокомолекулярных соединений из низкомолекулярных субстратов. Так, процессы окисления, идущие с выделением тепла, сопровождаются промежуточным синтезом АТФ, а процессы синтеза белков и других высоко молекулярных соединений, идут с поглощением тепла.

Вся кооперативная энергия в организме вырабатывается на клеточном уровне и расходуется на жизнеобеспечение самой клетки и на внешнюю по отношению к клетке работу (деятельность).

Первичная метаболическая энергия (в виде АТФ и кооперативных гидродинамических потоков гиалоплазмы) производится в митохондриях и частично в цитоплазме за счёт реакций окисления. Цикличность переноса вещества вовнутрь митохондрии и клетки и обратно обеспечивается цикличностью реакций синтеза и диссоциации.

МИТОХОНДРИЯ КАК БИОЛОГИЧЕСКИЙ ДВИГАТЕЛЬ ВНУТРЕННЕГО СГОРАНИЯ

Условный цикл производства кооперативной энергии в животной клетке представляется следующим. По причине того, что и межклеточная жидкость, окружающая клетку, и цитоплазма, окружающая эндоплазматическую систему, состоят на 70% из воды, т.е. несжимаемой жидкости, даёт нам основание условно принять процесс в месте протекания реакций окисления и синтеза изохорическим. В местах изохорического разогрева происходит местное повышение давления, возникает перепад давления между зонами протекания реакций и остальной цитоплазмой. Органоидами эндоплазма- тической системы клетки, главным образом в которых протекают циклические процессы окисления, являются митохондрии, где синтезируется энергоноситель организма АТФ.

Митохондрии – наиболее обособленные структурные элементы цитоплазмы клетки, обладающие в значительной степени самостоятельной жизнедеятельностью, обладающие собственной ДНК. Они являются “энергетическими станциями клетки”, участвуют в процессах клеточного дыхания и преобразуют порядка 40% энергии окисления субстратов в АТФ, в форму энергии доступную при использовании в многочисленных клеточных процессах. Принято считать, что остальные 60% выделившейся при окислении энергии превращаются в тепло и выводятся из клетки и организма. В световом микроскопе митохондрии выглядят в виде округлых (шарообразных) или удлинённых (палочкообразных) структур длиной 0,3 – 5 мкм и шириной 0,2 – 1 мкм. С помощью электронной микроскопии установлено, что митохондрии являются органеллами с двойными мембранами. Между наружной и внутренней митохондриальными мембранами расположено межмембранное пространство толщиной 10 – 20 нм. Внутренняя мембрана, имея большую площадь чем внешняя, образует многочисленные гребневидные складки – кристы. Кристы существенно увеличивают поверхность внутренней мембраны, обеспечивая значительное место для размещения дыхательной цепи. В митохондриях локализованы и ферменты, катализирующие окислительные реакции. Большая часть белков митохондрий синтезируется вне митохондрий и контролируется ядром, митохондриальная ДНК кодирует лишь немногочисленные митохондриальные белки. Наблюдались случаи перемещения митохондрий в протоплазме. Считается, что доставка АДФ, ферментов, кислорода, субстратов для реакций окисления в матрикс, и вывод из матрикса в цитоплазму углекислого газа и АТФ, последовательно через две мембраны митохондрии, осуществляется методом активного транспорта. В зависимости от функциональной активности клеток, количество митохондрий в них изменяется от сотен до десятков тысяч. [2,4,11,12].

В [5] высказано предположение, что, митохондрия использует энергию окисления, получаемую в соответствии с законом Гесса, более рационально, чем принято считать. 40% используется в процессе фосфорилирования АТФ, а 60%, выделяясь в объёме матрикса митохондрии, вызывают местный подъём температуры и как следствие давления. Повышенное давление в области матрикса сдавливает кристы, происходит сжатие митохондрии и она работает как сильфонный насос. Биологический раствор выдавливается в форме гидродинамического потока из межмембранного пространства и матрикса митохондрии.

Строение внутренней мембраны митохондрии – классический пример рациональности природы. С одной стороны это большая, развитая поверхность для течения реакций окисления и синтеза АТФ, с другой – возможность получения гидродинамического потока на принципах сильфона.

Прежде чем описать принцип производства гидродинамических потоков митохондрией отметим, что в клетке есть ещё одна структура с двойной мембраной. Это ядро. В ядре имеются многочисленные ядерные поры, соединяющие внутреннее пространство ядра с цитоплазмой и протоки, соединяющие межмембранное пространство ядра с полостью ретикулума. “Ядерная оболочка пронизана множеством расположенных упорядоченно ядерных пор округлой формы диаметром 50 – 70 нм, которые в общей сложности занимают до 25% поверхности ядра. Через ядерные поры осуществляется избирательный транспорт крупных частиц, а также обмен веществ между ядром и цитоплазмой”. [11, стр.31]. “Перинуклеарное пространство составляет единую полость с эндоплазматическим ретикулумом”. [11, стр.31 и Рис.1, стр. 18].

Схожесть морфологии митохондрии и ядра позволяет, во-первых, высказать предположение о единстве эволюционного происхождения митохондрии и клеточного ядра. Во-вторых, высказать предположение о наличии у митохондрии пор наподобие ядерных, соединяющих матрикс митохондрии с цитоплазмой и наличие проток, соединяющих межмембранное пространство митохондрии с эндоплазматическим ретикулумом.

Рис.1

Гидродинамические потоки, вырабатываемые митохондриями, и являются движущей силой внутриклеточного сборочного конвейера, основой активного внутриклеточного транспорта. Потоки упорядоченно движутся по развитой циркуляционной системе клеточного ретикулума.

В предложенной модели отпадает необходимость в прохождении крупных молекул в матрикс через две мембраны с помощью активного трансмембранного транспорта. Замеченные активные перемещения митохондрий в цитоплазме можно объяснить следующим. Когда случается отрыв протоки митохондрии от ретикулума, то в процессе сжатия у митохондрии возникает реакция струи, которая и вызывает её перемещение. Интересно отметить и такой факт. В [12, Том1] на Рис. 5.31 изображена электронная микрофотография лизосомы, внутри которой перевариваются, захваченные ею, старые митохондрии. Все митохондрии на фото имеют округлую форму, нет ни одной палочкообразной. Это можно объяснить тем, что оторвавшаяся старая митохондрия, сработав остатки субстратов внутри матрикса, успевает принять округлую форму. А вот для принятия палочкообразной формы у неё уже нет возможности.

Окислительные реакции, протекающие в митохондриях, или реакции цикла Кребса, в которых высвобождается и запасается большая часть энергии, по праву получили название – энергетический котёл, так как основываются на тех же законах физической химии, что и технические устройства. На фотографиях, полученных с помощью электронных микроскопов, митохондрии имеют или округлую или вытянутую цилиндрическую форму. Это говорит не о различной морфологии, а о различных функциональных состояниях митохондрии.

Возникшим кооперативным гидродинамическим потоком, с одной стороны, выносятся в межклеточную жидкость продукты распада от реакций окисления и продукты синтеза в клетке, которые используются всем организмом, с другой стороны – происходят перемещения по эндоплазматической системе, обеспечивающие функционирование самой клетки. Скажем, перенос информационной РНК, сформировавшейся в ядрышке на матричном гене ДНК, к тому месту эндоплазматической сети, где в рибосоме на матричной базе информационной РНК происходит синтез соответствующего белка. Процесс кооперативного движения протекает до тех пор, пока давление в зонах повышения давления не сравняется с давлением в межклеточной жидкости. Поток из митохондрии и клетки вовне прекращается. Однако в течение кооперативного процесса в соответствующие зоны эндоплазматической системы доставлены исходные материалы для протекания реакций синтеза высокомолекулярных соединений, необходимых организму для функционирования и регенерации. Реакции синтеза – это эндотермические реакции и они протекают с затратой энергии. То есть в полостях эндоплазматической сети, где протекают реакции синтеза, снижается температура и соответственно давление, в результате чего вновь появляется перепад давлений между межклеточной жидкостью и средой эндоплазматической сети, но направленный во внутрь клетки. Вновь возникает кооперативный гидродинамический поток по эндоплазматической сети от меж- клеточной жидкости через внешнюю мембрану во внутрь клетки. При этом в клетку из межклеточной жидкости доставляется новая порция субстратов и других необходимых элементов для протекания следующего функционального цикла клетки и в частности “перезарядка” митохондрий. Как на Рис.1 справа. Поток вовнутрь продолжается до выравнивания давления и температуры внутри клетки и в межклеточной жидкости. Функциональный цикл окисления – синтеза животной клетки замкнулся.

Митохондриальный и клеточный цикл энергопревращения в целом соответствует циклу сильфонно поршневого двигателя. [7,8]. Отметим, что для возможности таких процессов мы предполагаем у митохондрии дополнительные морфологические особенности. А именно наличие двойных пор – 1 (Рис.1) как у клеточного ядра и наличие трубчатых каналов – 2 (Рис.1), соединяющих межмембранную полость с полостью ретикулума. Без таких морфологических особенностей митохондрия не сможет циклически работать. На эту мысль нас навела работа сильфонно поршневого двигателя. А конструкция сильфонно поршневого двигателя зародилась при изучении морфологии митохондрии. Отметим ещё раз, что при таких морфологических особенностях снимается проблема интенсивного пропуска субстратов через двойную мембрану митохондрии. В [7,8] показано, что митохондриальный цикл реализует принципиально иной способ преобразования тепла в работу, нежели тот, что реализуется в сегодняшних тепловых машинах. Этот, реализованный в живой природе принцип преобразования тепла в работу позволяет снять противоречие между теоретической термодинамикой и экспериментальной биофизикой. В экспериментальной биологии ещё более 50-ти лет назад установлены удивительные факты, противоречащие устоявшимся представлениям классической термодинамики. Так КПД мышечной деятельности черепахи достигает эффективности в 75-80%. [1]. При этом перепад температур в клетке не превышает долей градуса, что необъяснимо с позиций классической термодинамики.

В качестве примера опишем возможный механизм обмена между внутренней полостью ядра и цитоплазмой.

Рис. 2

Если предположить, что внутренняя мембрана ядра по площади больше внешней мембраны (как у митохондрии), то при поступлении потоков в межмембранное пространство ядра, (как на Рис.2, слева) межмембранное пространство раздувается, а внутренняя полость ядра сдавливается и содержимое ядра выдавливается через ядерные поры в цитоплазму. Этим потоком смывается сформировавшаяся в ядрышке информационная РНК и выносится к рибосомам цитоплазмы. На второй стадии (Рис.2, справа) содержимое межклеточной полости двойной ядерной оболочки, по причине циклической работы митохондрий, перетекает в митохондрии, что приводит к поступлению в полость ядра из цитоплазмы мономеров для формирования РНК или ДНК. Округлая форма и общий объём ядра за цикл не меняется по причине меньшей по площади поверхности внешней ядерной мембраны. Происходит только локальное перетекание гиалоплазмы. В случае с ядром разница в площадях внешней и внутренней мембран не приводит к изменению внешней формы как у митохондрии по причине того, что с одной стороны у ядра имеется большое количество пор, с другой – внутренняя мембрана ядра не имеет кристов. В [3] показана решающая роль митохондрий в сократительных процессах миоцитов. В [8] описана конструкция теплового двигателя, работающего на тех же физико-химических принципах, что и митохондрия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимо проведение исследований митохондрий с помощью электронного микроскопа для выявления митохондриальных пор и проток, соединяющих межмембранное пространство митохондрии с полостью эндоплазматического ретикулума, как у клеточного ядра. В случае их обнаружения изменится, принятая на сегодня картина обмена между матриксом митохондрии и цитоплазмой. Будет подтверждён принципиально новый биологический принцип преобразования тепла в работу. Получит объяснение высокий КПД мышечной деятельности, вытекающий из опытов Хилла и противоречащий классической термодинамике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонов В.Ф. и др. Биофизика. – М.: “Владос”, 2003г., 288с.

2. Бышевский А.Ш., Терсенёв О.А. Биохимия для врача. Екатеринбург. Изд-во “Уральский рабочий”, 1994г., 384с.

3. Долгов М.А., Косарев А.В. Взаимодействие эластического и гидродинамического компонентов в процессе сокращения и расслабления мышечного волокна. //Вестник Оренбургского гос. у-та №12(79), 2007г., с. 106-112. http://vestnik.osu.ru/2007_12/21.pdf.

4. Каменский А.А. и др. Биология. – М.: ЭКСМО, 2003г., 640с.

5. Косарев А.В. Биодинамика, механизм и условия производства кооперативных потоков энергии в биологических структурах. // Вестник Оренбургского гос. у-та. №6, 2004г., – с. 93-99. http://vestnik.osu.ru/2004_6/17.pdf.

7. Косарев А.В. Монография “Динамика эволюции неравновесных диссипативных сред”. Издание второе, переработанное и дополненное. – Из-во: LAMBERT Academic Publishing, г. Саарбрюккен, Германия, 2013г., 354с.

8. Косарев А.В. Тепловой двигатель на новом термодинамическом принципе преобразования тепла в работу и его работа на естественных перепадах температур возобновляемых источников энергии.

9. Николис Г., Пригожин И. Самоорганизация в неравновесных системах. – М.: “Мир”, 1979г., 512с.

10. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. – Санкт-Петербург: “СпецЛит”, 2004г., 496с.

11. Сапин и др. Анатомия человека. Т.1 –М.: “ОНИКС”, 2002г., 464с.

12. Тейлор Д. и др. Биология. / Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. /Пер. с англ. Ю.Л. Амченкова, М.Г. Дуниной и др.). – М.: “Мир”. Том 1, 2001г., 454с. Том 2, 2002г., 436с. Том 3, 2002г., 451с.

Связь с автором публикации (комментарии/рецензии к публикации)

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться, чтобы оставить комментарий.

Источник

SERS — изучение цитохрома с в живых митохондриях

Об авторе

Эвелина Ильинична Никельшпарг — аспирантка кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. Область научных интересов — структура и функционирование митохондрий, спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния, фотобиология. Победитель конкурса «Био/мол/текст» 2015 г. в номинации «Своя работа».

Жалюзи опущены. Выключен свет. Мы погружены во мрак. Капля мутной жидкости падает на серебряную подложку. Вспышка зеленого света. 30 секунд. Спектр. Так начинается наш длинный рабочий день. А теперь обо всем по порядку.

Капля мутной жидкости — это суспензия митохондрий, клеточных органелл размером всего 1–2 мкм. Правда, органеллами они стали не сразу: согласно теории симбиогенеза, митохондрии появились в эукариотических клетках как бактерии-симбионты и за миллиарды лет обросли множеством функций.

В митохондриях протекают сложнейшие биохимические и биофизические процессы. Основные из них: окисление питательных веществ и производство молекул АТФ — универсального источника энергии для большинства биологических процессов в клетках. Кроме того, митохондрии участвуют в инициации апоптоза, старении клеток, продукции активных форм кислорода, метаболизме лекарств, выработке тепла, запасают в себе ионы кальция, синтезируют некоторые гормоны и т. д. [1].

Митохондрии обладают столь широким спектром функций, что нарушение их работы может стать причиной множества болезней: различных видов миопатий (атрофии мышц), сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и др. [2]. Большинство из них связаны с мутациями в генах, кодирующих белки митохондрий, но может быть и наоборот: некоторые заболевания или неправильный образ жизни (ожирение, употребление наркотиков и т. д.) могут привести к нарушению работы митохондрий. Механизмы этих процессов волнуют прежде всего биологов, но и для физиков митохондрии представляют большой интерес как преобразователи энергии и фактически белковый электропровод [3].

Как все устроено

Митохондрии состоят из двух мембран: внешней, проницаемой для ионов и некоторых белков, и внутренней, где находятся четыре белковых комплекса дыхательной цепи (или электрон-транспортной цепи, ЭТЦ) и АТФ-синтаза (рис. 1). Внутренняя мембрана образует множество складок, называемых кристами (от лат. crista — гребень), и ограничивает внутреннее пространство — матрикс, где содержатся ферменты цикла трикарбоновых кислот, или цикла Кребса. Также в митохондриях есть подвижные элементы комплекса дыхательной цепи: водорастворимый белок цитохром с и жирорастворимый убихинон, также известный как кофермент Q.

Рис. 1. Комплексы дыхательной цепи, локализованные во внутренней мембране митохондрий. I — фермент НАДН-дегидрогеназа окисляет НАДН с передачей двух электронов на убихинон (Q), при этом из матрикса в межмембранное пространство поступает четыре протона; II — фермент сукцинатдегидрогеназа связывает кофактор ФАД и окисляет сукцинат до фумарата с восстановлением Q; так как эта реакция дает меньше энергии, чем окисление НАДН, комплекс II не осуществляет перенос электронов; III — цитохром bc₁-комплекс (тип цитохрома показан в серых кружках) катализирует две реакции: окисление Q и восстановление цитохрома с, при этом два протона, высвобождаемые QH₂, уходят в межмембранное пространство; IV — фермент цитохромоксидаза оксисляет цитохром с (зеленые кружки) и восстанавливает кислород (электроны переносятся на кислород, и протоны перекачиваются из матрикса в межмембранное пространство, при этом кислород восстанавливается до воды), затем АТФ-синтаза использует полученную энергию (протоны) для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Черными стрелками показан транспорт электрона, пунктирной стрелкой — диффузия цитохрома с от комплекса III к IV, зелеными стрелками — перенос протона

Принцип работы дыхательной цепи — окисление субстратов, поступающих из цикла Кребса, и перенос электронов от них с помощью кофакторов ЭТЦ на конечный акцептор — кислород. Есть определенная закономерность в последовательности переноса электронов: они поступают от донора с более отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, или редокс-потенциалом (Е_red/ox, от англ. reduction — восстановление, oxidation — окисление), к акцептору с более положительным Е_red/ox. Таким образом, электрон как будто движется вниз по течению, определяемому Е_red/ox переносчиков электрона. Во время переноса электронов некоторые комплексы дыхательной цепи закачивают протоны из матрикса в межмембранное пространство, тем самым создавая электрохимический потенциал на внутренней мембране митохондрий, который используется для синтеза АТФ (см. рис. 1) [1].

Замечу, что митохондрии — очень популярный объект исследования. Их изучали такие корифеи науки, как Х. А. Кребс, П. Д. Митчелл, А. Л. Ленинджер, Б. Чанс, В. П. Скулачев и многие другие, и благодаря им известно об этих органеллах уже немало, но еще не все. Многие митохондриальные процессы и свойства переносчиков электронов до сих пор не изучены, что связано в первую очередь с отсутствием подходящих неинвазивных методик. В прошлом году мы, сотрудники лаборатории биофизики клетки биофака МГУ им. М. В. Ломоносова, вместе с коллегами, работающими на других факультетах нашего университета и в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН, а также с учеными из Германии и Дании создали методику для селективного исследования конформации гема цитохрома с непосредственно в живых митохондриях [4]. Что же такое конформация гема и почему она важна?

Редокс-потенциал и конформация гема

Если приглядеться к комплексам дыхательной цепи, локализованным во внутренней мембране митохондрий, то в трех из них можно увидеть цитохромы — гемсодержащие белки, которые служат кофакторами, участвующими в переносе электронов, и еще один, который диффундирует в межмембранном пространстве (см. рис. 1). Всего в митохондриях имеется три типа цитохромов — а, b и с. Они очень похожи, отличаются лишь боковыми радикалами (рис. 2).

Рис. 2. Гемы цитохромов разных типов. Каждый гем состоит из четырех пятичленных азотсодержащих циклов (порфиринов), связанных между собой [1]. Атомы азота координируют атом железа (Fe). Гемы отличаются боковыми группами, и только гем типа с связан с белком ковалентно

Во время переноса электрона меняется редокс-состояние атома железа (Fe 3+ /Fe 2+ ), который располагается в геме цитохромов, что приводит к изменению его конформации. Эти два параметра (Е_red/ox и конформация гема) всегда связаны друг с другом. Конформация гема цитохромов также зависит от белкового окружения [5, 6]. А так как Е_red/ox определяет эффективность переноса электрона, то конформация гема — вещь важная. Кроме того, чтобы произошел перенос электрона с одного цитохрома на другой, нужно, чтобы их гемы находились на определенном расстоянии друг от друга и были правильно ориентированы. Поэтому любые изменения в цитохромах могут отражаться на эффективности переноса электрона, т.е. на работе всей дыхательной цепи и, как следствие, энергообеспечении клеток [7, 8].

Наиболее интересен в этом отношении цитохром с. Так как это единственный мобильный переносчик электронов, курсирующий в межмембранном пространстве (все остальные цитохромы заякорены в комплексах ЭТЦ), он наиболее подвержен изменениям, которые могут происходить в митохондриях. Помимо этого выход цитохрома с запускает каскад реакций, ведущих к апоптозу, и в этом процессе тоже важен его редокс-потенциал [9].

Возникает вопрос, как оценить Е_red/ox и понять, в какой конформации и в каком редокс-состоянии находится гем цитохрома с в митохондриях?

Численно определить Е_red/ox можно с помощью электрохимических методов. Однако для этого нужные комплексы ЭТЦ изолируют и помещают в совершенно иные условия среды, что может само по себе изменить их свойства. Благодаря таким мощным методам, как ядерно-магнитный резонанс и рентгеноструктурный анализ, мы знаем, в какой конформации находятся белки и кофакторы дыхательной цепи в окисленной и восстановленной форме. Но нас интересует их состояние в максимально естественных условиях, а также соотношение этих состояний при работе дыхательной цепи.

Существует несколько неинвазивных методов для определения окислительно-восстановительного состояния цитохромов. Например, абсорбционная спектроскопия, основанная на использовании способности вещества к избирательному поглощению световой энергии. Спектр поглощения митохондрий включает спектр всех имеющихся цитохромов в митохондриях, а также небелкового компонента — ФАД, который входит в состав фермента сукцинатдегидрогеназы (II компонент дыхательной цепи, см. рис. 1). Но из-за того, что все типы цитохромов очень похожи и, соответственно, обладают схожими спектрами поглощения, а их окислительно-восстановительное состояние все время меняется при нормальной работе дыхательной цепи, сложно оценить вклад различных цитохромов в спектр [10].

По спектрам флуоресценции НАДН и ФАД + можно примерно оценить редокс-состояние только I и II комплексов дыхательной цепи. А по потенциалу на внутренней мембране митохондрий можно судить только о работе митохондрии в целом [11].

Напрямую получение информации о конформации и редокс-состоянии цитохрома с в целой и функционирующей (интактной) митохондрии — это крайне сложная задача, ведь его конформация постоянно меняется при работе дыхательной цепи, он диффундирует и взаимодействует с мембранными комплексами. Наличие метода, который позволял бы это сделать, значительно облегчило бы задачу и расширило знания о влиянии цитохрома с на активность ЭТЦ и его вкладе в развитие митохондриальных патологий.

Новые возможности старого метода

Риc. 3. Рассеяние света на молекуле, устройство спектров комбинационного рассеяния света (КР) и схема переходов между колебательными подуровнями и электронными уровнями молекулы. Спектры КР представляют зависимость интенсивности сигнала от частотного сдвига, Δν [см −1 ], а не от длины волны. В этом случае спектры не зависят от выбора лазера и их можно сравнивать. S₀ и S₁ — основной и первый возбужденный электронные уровни со структурой колебательных подуровней. Серой пунктирной линией обозначен виртуальный подуровень (в случае, когда энергии кванта не хватает для перехода на существующий подуровень). 1 — поглощение кванта инфракрасного (ИК) излучения приводит к переходу молекулы на новый колебательный подуровень; 2 — стоксово КР наблюдается, когда молекула находится в невозбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на более высокий колебательный подуровень, при этом энергия рассеянного света меньше энергии возбуждающего света (зеленый → оранжевый); 3 — рэлеевское рассеяние, не приводящее к изменению энергии (и, соответственно, длины волны) возбуждающего света; 4 — антистоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в возбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на нижний колебательный подуровень, при этом энергия рассеянного света будет больше энергии возбуждающего света (зеленый → синий); 5 — флуоресценция: квант света вызывает электронно-колебательный переход, после чего наблюдается релаксация (бордовая фигурная стрелка) и испускание света с меньшей энергией (синий → красный)

Исторически в нашей лаборатории для изучения конформационных состояний различных биологических молекул используют метод комбинационного рассеяния света (КР). Это явление основано на эффекте неупругого (рамановского, или комбинационного * ) рассеяния оптического излучения на молекулах вещества. При обычном (упругом, или рэлеевском) рассеянии частота (и длина волны) излучения не меняется, а при неупругом — меняется. Это выражается в появлении дополнительных линий (линий КР) на спектре рассеяния (рис. 3). Какую же информацию он несет?

Под «взаимодействием» света с молекулой подразумевается энергетический обмен между фотонами и колебательными подуровнями энергии молекулы. Это означает, что спектр КР несет в себе информацию о колебаниях атомов в молекулах исследуемого вещества. Строго говоря, разность частот возбуждающего и рассеянного света (Δν) характеризует нормальные частоты колебаний молекулы в целом. Большинство пиков на спектре КР обусловлено колебаниями сразу нескольких химических связей в молекуле, но некоторые пики описывают колебания определенных групп атомов (рис. 4) [12, 13]. С помощью таких ключевых колебаний можно определить, с чем мы имеем дело — с липидами, белками, ДНК, порфиринами или другими молекулами. И для каждой молекулы будет свой неповторимый спектр КР — нечто вроде «отпечатков пальцев» молекулы. И так же, как по отпечаткам пальцев можно различить близнецов, по спектрам КР можно отличить схожие по строению молекулы. Поэтому метод чрезвычайно популярен среди химиков-аналитиков и физиков, а также применяется в археологии, экологии, геологии и даже в криминалистике.

Первые биологические эксперименты с использованием метода КР велись еще в 1935 г. на аминокислотах. Однако, повторюсь, работы на изолированных молекулах не столь интересны для биологов, а для работы на целых клетках сигнал КР обладает низкой интенсивностью (и это один из существенных недостатков метода), поэтому метод не получил широкого распространения. И только в 1990 г., после совмещения КР-спектрометра с конфокальным микроскопом, появилась возможность регистрировать КР целых клеток или отдельных их участков. В последние годы метод наконец-то приобрел популярность, притом заслуженную, так как КР-спектроскопия обладает существенными преимуществами перед другими методами, и главное, позволяет получать эксклюзивную информацию.

Основное преимущество КР-спектроскопии — неинвазивность, т.е. с помощью этого метода можно изучать биохимический состав клеток, не разрушая их. Кроме того, не нужно использовать метки или зонды, как для флуоресцентной микроскопии. Это означает, что можно изучать систему (в нашем случае клетку) в естественных условиях, а это крайне важно, учитывая, что многие из существующих меток (как флуоресцентных, так и изотопных) токсичны. К тому же исчезает проблема выцветания меток и появляется возможность исследовать небольшие молекулы, к которым трудно «пришить» метку. Важно также, что метод КР позволяет работать с водными растворами, в том числе с физиологическими буферами, в отличие от ИК-спектроскопии, так как вода сильно поглощает в ИК-области.

Рис. 4. Гем типа b, который содержится в гемоглобине эритроцитов, и его спектр КР [13]. Различные группы атомов и соответствующие им пики обозначены одним цветом

Что касается эксклюзивной информации, то это в первую очередь информация о конформации исследуемых молекул и микроокружении функциональных групп. А от этих параметров может зависеть и активность молекул в клетке, и взаимодействие с другими молекулами, т.е. то, что влияет на работу целой клетки. Исследовать конформацию молекул — это сложная экспериментальная задача. Для ее решения можно использовать ИК-спектроскопию, но опять же только на высушенных образцах. Можно применять более сложные и дорогие технологии, такие как рентгеноструктурный анализ и ЯМР. Эти методы позволяют получать целостную картину расположения атомов в молекуле, но очевидно, их пока нельзя использовать для изучения молекул в живой клетке. А КР-спектроскопию можно: в зависимости от того, в какой конформации находится молекула, атомы будут колебаться по-разному, что отразится на спектрах.

К митохондриям от чистого сердца

О неинвазивном методе исследования цитохромов митохондрий в клетках сотрудники нашей лаборатории задумывались уже несколько лет назад, когда исследовали влияние окислительного стресса на клетки сердечной мышцы (кардиомиоциты) методом комбинационного рассеяния света [14]. Тогда удалось выяснить, что спектры КР разных типов цитохромов и миоглобина (который, как и гемоглобин, содержит гем типа b) можно различать по спектрам КР интактных клеток и даже определять их окислительно-восстановительное состояние. Позже Н. А. Браже с другими сотрудниками успешно провела подобное исследование на целом сердце, т.е. in situ (рис. 5) [15].

Рис. 5. Регистрация спектра КР целого сердца [15]

Однако у цитохромов есть одна особенность — только для восстановленных их форм спектр КР интенсивен. Если ориентироваться только на этот критерий, можно потерять важную информацию об изменениях в исследуемой системе, ведь интенсивность зависит и от количества молекул, и от выраженности тех или иных колебаний, и от других параметров. К тому же для определения точного положения пиков большинство исследователей, имеющих дело с цитохромами, вынуждены искусственно восстанавливать образцы, что заведомо нарушает их нативность.

Отчасти проблему решили японские ученые. Они определили, какие пики на спектре КР характерны только для восстановленных цитохромов, а какие — только для окисленных [16]. Однако проблема интенсивности спектров по-прежнему сохранялась, и нужно было ее решать.

Один из способов усилить сигнал КР — это поместить исследуемую молекулу вблизи наночастицы благородного металла, например золота или серебра. Эти металлы обладают свободными поверхностными электронами. Квант их коллективных колебаний называется плазмоном. Если частота падающего света входит в резонанс с частотой колебаний поверхностных электронов металла, то возникает эффект плазмонного резонанса, который приводит к многократному усилению электромагнитного излучения вблизи наночастицы. Этот эффект используют в методе поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR), в абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии. Но нам нужен был способ, позволяющий усилить именно КР-сигнал. И для этого существует спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (SERS, англ. Surface enhanced Raman spectroscopy).

Спектры КР и SERS цитохрома с хорошо известны [17, 18]. И что самое замечательное, спектры SERS окисленного и восстановленного цитохрома с практически не отличаются по интенсивности. Так почему бы не зарегистрировать спектр SERS митохондрий?

Идея пришла от профессора Копенгагенского университета О. В. Сосновцевой, с которой наша лаборатория сотрудничает не первый год. На тот момент было только две работы по изучению митохондрий методом SERS и его разновидностью TERS (Tip-enhanced Raman spectroscopy). В первой работе исследователи регистрировали спектр SERS только от белков и липидов митохондрий, но не от цитохромов, а во второй работе — использовали не нативные, а высушенные митохондрии [19, 20].

Но как применить метод SERS для изучения цитохромов живых митохондрий? Прежде чем ответить на этот вопрос, переместимся в недалекое прошлое.

Междисциплинарность — залог успеха

В 2010 г., когда возник интерес к нанотехнологиям, академик Ю. Д. Третьяков (в то время декан факультета наук о материалах МГУ) инициировал межфакультетское сотрудничество с биологами для проведения совместных исследований методом SERS. Так началась совместная работа нашей лаборатории под руководством Г. В. Максимова с группой химиков-материаловедов во главе с Е. А. Гудилиным.

Дело в том, что SERS — метод непростой и требует исключительно междисциплинарного подхода. Каждый биологический объект уникален, и чтобы регистрировать от него сигнал SERS, нужно разрабатывать особые наноструктуры, которые усиливали бы сигнал от нужного объекта, при этом не повреждали его и выдерживали «атаку» физиологических многокомпонентных буферов.

Большинство работ, связанных с SERS, предполагают адсорбцию молекул на поверхности наноструктур, пусть даже введенных внутрь клетки [21]. Это связано с тем, что усиление сигнала КР наблюдается только на очень небольшом расстоянии от поверхности металла [22]. Однако такой подход не всегда удовлетворяет запросам биологов. В идеале усиление сигнала должно распространяться на достаточно большое расстояние (только так можно работать с целыми клетками и органеллами, не повреждая их), и желательно не вводить ничего внутрь. Для этой цели нужно было разработать специфический дизайн наноструктур и придумать методы их синтеза, чем и занялась группа Гудилина.

Наконец длительные и упорные попытки разработать такие структуры для исследования живых клеток увенчались успехом. В 2012 г. дебютировали наноструктурированные подложки для усиления сигнала от примембранного гемоглобина в интактных эритроцитах [13]. За счет определенной морфологии наноструктур удалось получить усиление сигнала на расстоянии более 10 нм, т.е. больше толщины мембраны эритроцита.

Раз это удалось сделать для эритроцитов, то можно сделать и для митохондрий!

Долгожданный спектр SERS митохондрий

Жалюзи опущены. Выключен свет. Комната погружена во мрак. Капля суспензии падает на серебряную подложку. Вспышка зеленого света. 30 секунд. Спектр. Тот самый долгожданный спектр SERS от изолированных сердечных митохондрий был получен! Оставалось только понять, от каких именно структур в митохондриях исходит сигнал.

Рис. 6. Схема эксперимента на изолированных сердечных митохондриях, помещенных на серебряную наноструктурированную поверхность и облученных зеленым лазером [4]. На рисунке показаны размеры мембраны, межмембранного пространства и участков комплекса дыхательной цепи. VDAC — потенциал-зависимый анионный канал, FCCP — протонофор, разобщающий электронный транспорт и синтез АТФ, олигомицин — ингибитор АТФ-синтазы, зеленые и серые кружки — цитохромы

С учетом размеров компонентов митохондрий (рис. 6) и того, что усиление наблюдается на расстоянии нескольких нанометров от наноструктур, можно было предположить, что спектр SERS митохондрий будет преимущественно спектром цитохрома с, так как этот цитохром наиболее близко подходит ко внешней мембране митохондрий и, соответственно, к наноструктурам. В то же время остальные цитохромы закреплены в комплексах внутренней мембраны. Это также подтверждалось при моделировании эффектов усиления КР серебряными наноструктурами, которые были использованы в работе. Группа наших коллег из лазерного центра Ганновера показала, что сложная морфология подложки со множеством углублений, в которые могут попадать митохондрии, позволила получать усиление на большом расстоянии (более 10 нм). А иерархическое устройство самих наноструктур увеличивало число мест контакта с мембраной митохондрий и, следовательно, количество молекул цитохрома с, от которых можно было зарегистрировать сигнал SERS. Если использовать те же наночастицы серебра, просто присоединенные к плоской подложке, то особого усиления не произойдет, что и подтверждалось в эксперименте (рис. 7).

Рис. 7. Изображения иерархических наноструктур (вверху слева) и наночастиц на плоской поверхности (справа), полученные на сканирующем электронном микроскопе [4]. Под каждой микрофотографией приведены соответствующие им модели взаимодействия митохондрий с этими структурами

И действительно, полученный спектр SERS митохондрий соответствовал спектрам цитохрома с. При использовании зеленого лазера в качестве возбуждающего света можно регистрировать сигнал только от цитохромов b и с, но не от цитохрома а, что облегчает задачу расшифровки спектров. Несмотря на схожесть структуры цитохромов типа b и с, они имеют ключевые пики на спектре, благодаря которым их нельзя перепутать (рис. 8). Таким образом, используемые наноструктуры давали усиление на расстоянии, достаточном, чтобы зарегистрировать спектры от цитохрома с, но недостаточно большом, чтобы увидеть пики цитохромов b. А это как раз то, что нужно! Благодаря методу SERS теперь можно исследовать селективно редокс-состояние и конформацию именно цитохрома с в живых функционирующих митохондриях.

Рис. 8. Спектры SERS интактных митохондрий (слева), помещенных на серебряную наноструктурированную поверхность [4]: 1 — спектр искусственно восстановленных цитохромов митохондрий; 2 — спектр активно функционирующих интактных митохондрий. Для сравнения справа приведен спектр SERS эритроцитов, который соответствует спектру гема типа b, и спектр окисленного изолированного цитохрома с. Красным цветом отмечены пики, по которым можно четко отличить спектр гемов b и с

Как и ожидалось, спектры SERS цитохрома с митохондрий оказались очень чувствительны к изменению его окислительно-восстановительного состояния. Для этого было исследовано два воздействия: внесение переносчика протонов (протонофора) FCCP и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина. FCCP встраивается во внутреннюю мембрану митохондрий и начинает переносить протоны из межмембранного пространства в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В итоге количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается [23]. В таком случае возрастает количество поглощенного кислорода и скорость окисления субстратов, а следовательно, и количество окисленных молекул цитохрома с, что очень хорошо видно на спектрах SERS. И наоборот, добавление ингибитора синтеза АТФ — олигомицина, который приводит к увеличению электрохимического градиента на фоне снижения скорости дыхания, увеличивает количество восстановленных молекул цитохрома с, что также выражено на спектрах SERS митохондрий. Таким образом, спектры SERS митохондрий, являясь спектрами исключительно цитохрома с, оказались чувствительны к изменениям его конформации и редокс-состояния в процессе работы митохондрий.

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния позволяет многократно усилить сигнал КР от молекул вблизи наночастиц металла. Однако для проведения успешных экспериментов необходимо учитывать свойства как биологического объекта, так и наноструктур. По словам одного из главных авторов проекта Н. А. Браже, ключевым моментом нашего достижения стал междисциплинарный подход к работе, в которую были вовлечены биологи, химики и физики. Результатом такого подхода стало создание уникальной методики селективного определения редокс-состояния и конформации цитохрома с в живых функционирующих митохондриях, помещенных на специальную наноструктурированную поверхность. Разработанная методика поможет восполнить пробелы в наших знаниях о свойствах и поведении переносчиков электрона в митохондриях. Она также может быть использована для разработки диагностических тестов для раннего выявления патологий митохондрий, чем и планируется заниматься в ближайшее время.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 14-13-00871) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 14-04-31883-mol-a).

* Впервые появление новых линий в спектре рассеянного света на кристаллах кварца наблюдали в 1928 г. наши соотечественники Г. С. Ландсберг и Л. И. Мандельштам, которые назвали увиденное комбинационным рассеянием света. Вскоре это явление наблюдали индийские ученые Ч. В. Раман и К. С. Кришнан на жидкостях, используя в качестве источника света солнечные лучи. Впоследствии за открытие эффекта неупругого рассеяния света только Раман был удостоен Нобелевской премии (1930), а метод, основанный на этом оптическом эффекте, стал носить его имя — рамановская спектроскопия (Raman spectroscopy, RS). Однако в русскоязычной литературе чаще используется название, введенное Ландсбергом и Мандельштамом, — «комбинационное» рассеяние, спектр которого составляет комбинация частот возбуждающего света и собственных колебаний молекулы [12].

Источник