особенности микроскопии в микробиологической практике иммерсионная система
Техника микроскопирования с иммерсионной системой
Для микроскопии с иммерсионным объективом требуется хорошее освещение объекта. Для этого используется дополнительная система линз, расположенная под предметным столиком – конденсор. При подготовке микроскопа к работе конденсор с помощью специального винта перемещают вверх до упора. На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и помещают стекло на предметный столик. Под визуальным контролем сбоку опускают объектив до соприкосновения с каплей. После погружения объектива в каплю масла вращением макрометрического винта определяют контуры объекта, а затем с помощью микрометрического винта устанавливают четкое изображение объекта.
После окончания микроскопии иммерсионный объектив поднимают, препарат убирают, а фронтальную линзу объектива протирают от остатков масла мягкой салфеткой.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Устройство бактериологической лаборатории.
2. Правила работы в бактериологической лаборатории.
3. Принципы классификации микроорганизмов.
4. Формы бактериальных клеток.
5. Методы определения вида микробов.
6. Техника микроскопирования с иммерсионной системой.
Литература для подготовки к занятию:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.
Занятие 2
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Бактериоскопический метод. Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Методы выявления капсул, жгутиков, спор. Изучение микробов в живом состоянии.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Продолжить изучение бактериоскопического метода. Ознакомиться с простыми и сложными методами окраски бактерий. Освоить окраску по Граму. Изучить структуру бактериальной клетки. Освоить методы выявления капсул, жгутиков, спор микробов. Освоить методы изучения микробов в живом состоянии. Ознакомиться с бактериоскопическим методом исследования, методами окраски бактерий, а также изучения микробов в живом состоянии. Изучить строение бактериальной клетки и методы выявления спор, жгутиков, капсулы.
1. Познакомиться с простыми и сложными методами окраски бактерий. Освоить метод окраски по Граму.
2. Изучить структуру бактериальной клетки.
3. Изучить методы выявления капсул, жгутиков, спор микробов.
4. Освоить методы микроскопии микробов в живом состоянии.
Освоение техники микроскопии с иммерсионной системой.
Микроскопию окрашенных препаратов в микробиологической практике производят с иммерсионным объективом, который обладает более высокой разрешающей способностью, чем сухой. При этом обязательным условием является погружение объектива в масло, показатель которого совпадает с показателем преломления стекла (1,52). Для этих целей применяют так называемое иммерсионное масло – кедровое или терпеновое масло. В этом случае пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рассеивается и лучи, не меняя своего направления, попадают в объектив. Иммерсионный объектив дает увеличение х90 (х100), а в сочетании с окуляром х10 получается увеличение в 900 (1000) раз.
Порядок работы с иммерсионным микроскопом:
1. Поднять конденсор вверх до уровня предметного столика, поставить зеркало плоской стороной.
2. Поставить объектив х8 и, глядя в окуляр, движением зеркала добиться наилучшего освещения поля зрения.
3. На предметное стекло с микропрепаратом нанести каплю иммерсионного масла, положить его на предметный столик и установить объектив х90 (х100). Под контролем глаза, глядя сбоку, осторожно опустить, пользуясь макровинтом, тубус до погружения объектива в иммерсионное масло. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может привести к повреждению фронтальной линзы. Затем, наблюдая в окуляр, при осторожных поворотах макровинта находят контуры микробных клеток и фокусируют изображение микровинтом, вращая его в пределах только одного оборота!
По окончании микроскопии поднимите тубус, снимите препарат и поместите его в дезинфицирующий раствор; осторожно сотрите масло с иммерсионного объектива, опустите конденсор и переведите револьвер на объектив х8.
Изучите приготовленный препарат под микроскопом. Обратите внимание на форму микроорганизмов (кокки, палочки, извитые), на их размеры, взаимное расположение и окраску. При увеличении микроскопа около 900, бактерии, имеющие размер 1 мкм, будут выглядеть равными, примерно 1 мм. Таким образом, можно приблизительно определить размеры бактериальной клетки. Зарисуйте увиденные в поле зрения микроорганизмы в протоколе, соблюдая пропорции клеток. Опишите их, сделайте вывод.
После окончания работы необходимо привести рабочее место в порядок, сдать его дежурному и вымыть руки; в случае необходимости обработать руки дезраствором.
Промикроскопировать демонстрационные препараты стрептококков, бацилл сибирской язвы, окрашенные по методу Грама и полученные результаты занести в протокол.
Ожидаемые результаты: Streptococcus spp. Препарат из бульонной культуры. Грам (+) полиморфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, расположенные, в основном, цепочками.
Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, препарат из бульонной культуры. Грам (+) крупные палочки (5-10 х 1-2 мкм) с обрубленными концами, расположенные длинными цепочками в виде «бамбуковой трости».
ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ
Протокол-отчет№ ____от________Ф. И. О.____________№ группы________
| Цель | Метод и его содержание | Полученные результаты | Выводы |
5.4 Итоговый контроль знаний:
6. Домашнее задание для уяснения темы занятия:
— вопросы для самоконтроля:
1. Назовите отличительные признаки микроорганизмов, как представителей царства прокариот.
2. Какие свойства микроорганизмов лежат в основе микроскопического метода исследования?
3. Назовите и обоснуйте какие методы окраски микроорганизмов (простые или сложные) являются более информативными.
4. Обоснуйте дифференциально-диагностическое значение метода Грама в микробиологической практике.
5. Обоснуйте необходимость использования иммерсионной системы для изучения микроорганизмов.
7. Рекомендации по выполнению НИРС:
8. Рекомендованная литература по теме занятия:
Обязательная
1. Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: Учебник / О. К. Поздеев ; ред. В. И. Покровский. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 768 с.
Дополнительная
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник. в 2 т. / ред. В. В. Зверев, M. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011 – Т. 1. – 448 с.
3. Гиллеспи, С. Х. Наглядные инфекционные болезни и микробиология / С. Х. Гиллеспи, К. Б. Бамфорд; ред.-пер. С. Г. Пак, А. А. Еровиченков. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 136 с.
4. Хаитов, Р. М. Иммунология: учебник / Р. М. Хаитов. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 528 с.
5. Ярилин, А. А. Иммунология: учебник / А. А. Ярилин. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.
Иммерсионная микроскопия
Иммерсионная микроскопия – это методика микроскопического исследования различных объектов, основанная на введении между объективом и предметным стеклом иммерсионных жидкостей.
Данный иммерсионный метод микроскопии применяется для того, чтобы свет проходил через рассматриваемый предмет, иммерсионную жидкость, при этом луч не преломлялся. Благодаря этому происходит получение изображения более высокого качества и разрешения.
У «сухих» объективов по сравнению с иммерсионными значительно больше «паразитных» отражений, чего нельзя сказать о последних. За счет этого специалист, работающий на иммерсионном микроскопе, получает значительно увеличенное качество изображения, к тому же с повышенной контрастностью.
Немаловажным моментом в иммерсионном микроскопе является та самая жидкость, благодаря которой и получается изображение такого качества. При прохождении светового луча через предметное стекло с препаратом, он сталкивается в последующим с иммерсионной средой, которой является иммерсионная жидкость. Именно за счет нее происходит уменьшение преломления данного светового луча, и именно поэтому в объектив попадает гораздо больше света, что дает такую яркую, четкую картинку у исследователя.
На иммерсионном объективе всегда есть соответствующая маркировка, которая говорит о том, какой тип иммерсии имеется в нем:
Начало применения иммерсионных микроскопов ознаменовалось такими масляными иммерсионными средами, как кедровое масло, глицерин, масло вазелиновое. Однако, с течением времени ученые выяснили тот факт, что их свойство значительно меняется, масло начинает менять консистенцию, загустевания, вплоть до того, что становиться твердой массой, меняется его цвет, а, следовательно, и коэффициент преломления при микроскопировании. Что уже дает негативный эффект при проведении микроскопического исследования объекта. Именно поэтому было принято решение использовать только лишь синтетические масла в качестве иммерсионных сред, которые не обладают такими негативными моментами как натуральные продукты.
К тому же в современных вариантах иммерсионных микроскопов используются объективы, на которые нанесено специальное покрытие, которое улучшает цветопередачу при иммерсионной микроскопии, а также имеет защитные свойства, которые защищают объектив от мелких царапин в процессе эксплуатации соответствующего оборудования.
Иммерсионная система микроскопа
Многие начинающие любители микробиологии при упоминании иммерсионной системы представляют себе нечто сложное, дорогостоящее и совершенно им не нужное. Мол, это какая-то узкоспециализированная вещь, которая пригодится лишь профессионалам, а в домашнем хобби она совсем не нужна. Это не совсем верно. Возможно, она не всегда и всем пригодится, но точно проста в использовании и доступна многим. Иммерсионная система микроскопа – это всего лишь иммерсионный объектив. Как только вы установите его на свой микроскоп, он тут же превратится в иммерсионную систему. Иммерсионный объектив подойдет практически к любому световому микроскопу, а купить его можно в большинстве специализированных магазинов. Однако зачем он все-таки нужен?
Микроскоп с иммерсионным объективом используется для наблюдений иммерсионным методом. Согласно ему между объективом и образцом вводится жидкость, благодаря которой увеличивается разрешение и яркость изображения, уменьшается хроматизм картинки, а паразитные отражения практически исчезают. Иммерсионная жидкость также позволяет превысить высший предел увеличения микроскопа. Иммерсионное увеличение микроскопа может в 1,5–2 раза превышать максимальное полезное увеличение микроскопа с «сухим» объективом.
Различают объективы для масляной и для водной иммерсии. Для первых в качестве иммерсионной жидкости используется специальное синтетическое масло, для вторых – дистиллированная вода. Можно использовать и другие жидкости, например глицерин или органическое масло, но разрешение картинки будет низким.
Иммерсионное увеличение микроскопа
Если на вашем микроскопе установлен обычный «сухой» объектив, не предназначенный для иммерсионного метода исследований, вряд ли его кратность превышает 40х. А верхний предел увеличения микроскопа, вероятно, находится около отметки в 1000 крат. Заменив «сухой» объектив на иммерсионный, вы сможете изучать структуры образцов на кратности в 2000х без падения качества картинки. Но почему это невозможно без иммерсии?
Согласно физическим законам полезное увеличение микроскопа, при котором детали образцов хорошо различимы, не может превышать значение числовой апертуры объектива более чем в 1000 раз. Числовая апертура «сухого» объектива обычно составляет 0,95–1. Даже если он будет 100-кратным, а окуляры 20-кратными, на максимальном увеличении вы увидите лишь размазанную картинку. Изображению не будет хватать четкости и яркости. Иммерсионный метод исследований позволяет раздвинуть эти пределы. Объектив погружают в иммерсионную жидкость, благодаря которой апертура объектива увеличивается, а значит, и улучшается разрешение картинки. На больших увеличениях иммерсионный микроскоп демонстрирует большую детализацию и контрастность изображения в сравнении с обычными световыми моделями.
4glaza.ru
Август 2017
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Устройство светового микроскопа. Сущность и техника иммерсионной микроскопии. Правила работы с микроскопом
 |
| Рис. 4. Ход лучей в иммерсионной системе светового микроскопа |
Морфология микроорганизмов изучается с помощью микроскопа (рис. 3 –см. приложение). Разрешающая способность светового микроскопа (способность прибора «видеть» 2 точки раздельно) составляет 0,2 мкм (200 нм). Студенты должны быть знакомы с принципами устройства микроскопа. Особенностью микроскопического исследования в микробиологии является использование иммерсионной (immersio – погружать) системы. При этом виде микроскопии фронтальную линзу иммерсионного объектива с увеличением х90 (на нем имеется выгравированное кольцо черного цвета) погружают в каплю масла (кедрового, касторового или вазелинового), имеющего коэффициент преломления (1,51), близкий к показателю преломления стекла (1,52) во избежание потери света при переходе лучей из предметного стекла в воздушную среду (рис. 4). При микроскопии окрашенных объектов создают яркое освещение с помощью специального осветителя, зеркала, поднятого вверх конденсора и полностью открытой диафрагмы микроскопа. Неокрашенные объекты микроскопируют, ограничивая освещенность препарата, сужая диафрагму и опуская конденсор.
Правила микроскопии мазков с помощью иммерсионной системы:
· открыть диафрагму, поднять конденсор до уровня предметного столика.
· включить осветитель и установить освещенность поля зрения, пользуясь объективом х8.
· на мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла, поместить препарат на предметный столик.
· вращая револьвер с укрепленными на нем объективами, установить объектив х90, осторожно опустить тубус микроскопа с помощью макрометрического винта вниз до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла (почти до соприкосновения с предметным стеклом) под контролем глаза сбоку. Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта, выполняя эту манипуляцию очень осторожно, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива или предметное стекло. Окончательную фокусировку препарата осуществляют микрометрическим винтом, который рекомендуется вращать не более, чем в пределах одного оборота.
· после окончания работы необходимо тряпочкой из мягкой ткани тщательно вытереть масло с иммерсионного объектива, перевести револьвер на малый сухой объектив х8, выключить освещение.