Генномодифицированные лекарства что это
Как устроены ГМО и почему мы их так боимся
Что такое ГМО?
ГМО — генетически модифицированные организмы — это организмы, в ДНК которых были целенаправленно внесены изменения при помощи методов генной инженерии. То есть им были переданы отдельные гены от другого организма, не обязательно родственного. Обычно таким способом улучшают свойства растений и микроорганизмов, реже — животных или придают им совершенно новые характеристики.
Почему вокруг ГМО так много заблуждений?
По данным ВЦИОМ, больше 80% россиян настроены против ГМО. Подобные опросы проводились также в США, Франции и Германии. В этих странах около 90% населения также негативно относятся к искусственной модификации генома. Один из главных аргументов противников ГМО — какое-либо вмешательство в ДНК противоестественно. А значит, употребление в пищу ГМО-растений и продуктов может вызвать у человека опасные мутации и, как следствие, болезни.
При этом, согласно исследованию британских ученых, ярые противники ГМО гораздо хуже, чем их оппоненты, разбираются в базовых биологических понятиях, не говоря о генетике. По этой причине большинство респондентов неверно представляют себе, что вообще такое вмешательство в геном. На самом деле наука занимается этим достаточно давно. Еще в XVI веке первые агрономы-испытатели, не зная законов генетики, создавали растения-гибриды, отбирая для посева те сорта, которые были устойчивы к вредителям и приносили больше урожая. Это называется селекцией. С развитием науки были изобретены более совершенные методы — в частности, генная инженерия. Она позволила ученым в три раза ускорить процесс выведения новых сортов, или новых полезных свойств растений. Впрочем, даже используя такие современные и точные методы генетики, как, например, CRISPR/Cas9, невозможно создать такой генно-модифицированный продукт, который через кишечник человека смог бы встроиться в его ДНК. Более того, механизма, который позволил бы осуществить перенос генов таким образом, попросту не существует.
Ситуацию усугубляют и псевдонаучные публикации, которые содержат некорректные данные о ГМО, или же неверно их трактуют. Например, в феврале 2019-го в журнале Food and Chemical Toxicology вышел обзор о том, как генно-модифицированные продукты усваиваются человеческим организмом. В кратком содержании авторы пишут: «Убедительные свидетельства показывают наличие ДНК из еды (также генно-модифицированной еды) в крови и тканях человека и животных».
Однако если вчитаться в текст обзора, становится понятно, что на самом деле исследователи не нашли никаких тревожных признаков: в крови испытуемых не было повышенной концентрации трансгенной ДНК.
Наконец, мифы о ГМО успешно распространяются и на государственном уровне. К примеру, авторы сайта Центра гигиены и эпидемиологии при Роспотребнадзоре пишут об опасности ГМ-продуктов, ничем не подкрепляя эти заявления.
Одно из очевидных объяснений подобных предрассудков — банальная научная безграмотность противников ГМО или работа с некорректными источниками информации.
Правда ли, что ГМО — это вредно?
Существует множество исследований, которые доказывают, что ГМ-продукты безопасны. Например, доклад Национальных академий наук, техники и медицины США от 2016 года свидетельствует, что такие продукты не только не вредны, но даже полезны для человека. Авторы изучили более 900 научных работ, опросили 80 экспертов из различных областей, еще 26 привлекли к рецензированию доклада. В основном все проанализированные исследования касались двух типов ГМ-растений: устойчивых к насекомым и к химическим удобрениям. Данные за последние 20 лет показали, что эти сельхозкультуры никак не повлияли на людей и животных, которые ими питались.
Прежде, чем вывести ГМ-продукт на рынок, ученые проводят многолетние испытания. Они наблюдают, как ведут себя трансгены и продукты генной экспрессии, не вызывают ли они аллергии или отравления. Международное законодательство требует, чтобы каждый такой товар проходил жесткую проверку на безопасность для людей, животных и окружающей среды. Кроме того, в ЕС такие продукты отслеживают еще и годы спустя, чтобы выявить возможные отложенные риски.
Пока существует только два вероятных риска, связанных с применением ГМО, о которых, в частности, говорит ВОЗ:
Как ГМО двигает науку и медицину
Сегодня ГМО используют в двух главных сферах: сельское хозяйство и медицина.
Практически все продукты растительного происхождения на нашем столе — с измененными генами. Благодаря этому они дают больше урожая, приспосабливаются к суровому климату и недостаткам почвы, противостоят вредителям. Но главное — они становятся лучше на вкус, содержат больше полезных веществ и приобретают новые ценные свойства. Например, золотой рис — генетически модифицированный сорт риса с повышенным содержанием витамина А. Существует также особый сорт моркови, который содержит вакцину от туберкулеза.
Какое будущее у ГМО?
Несмотря на все сложности с разработкой и проверкой на безопасность, ученые уверены: в будущем человечеству не обойтись без трансгенных растений и продуктов. Мы сможем предотвращать голод или массовый неурожай, а также минимизировать вред для экологии: ГМО-растения можно реже поливать и возделывать беспахотным способом. Это позволит не только экономить воду, но и уменьшать парниковый эффект за счет снижения теплового излучения пашни. Кроме того меньшее количество сельхозтехники на полях поможет контролировать выбросы углекислого газа в атмосферу.
Вот несколько примеров того, на что способна генная инженерия:
Что такое генно-инженерная терапия?
Принимать ГИБП можно лишь по заключению врача
Генно-инженерная терапия — это современная терапия с применением генно-инженерных биологических препаратов. Генно-инженерные биологические препараты (ГИБП) — это лекарственные средства, различными по механизму действия. Они могут блокировать и ингибировать цитокиновые рецепторы, являются гуманизированными или человеческими моноклональными антителами и.т.д.
Говоря простым языком, в препаратах имеются молекулы, способные прерывать взаимодействия между клетками хозяина и субстанциями, провоцирующими бесконтрольное воспаление.
Такие лекарства используют только ревматологи?
Нет. Также эти препараты используют гематологи, онкологи, гастроэнтерологи, офтальмологи и неврологи, но назначаться они могут только узкоспециализированными экспертами. Ревматолог не может назначить терапию онкологическому пациенту, гастроэнтеролог — пациенту офтальмолога.
Всем ли пациентам с аутоиммунной патологией можно назначать такую терапию?
Связано ли это с высокой стоимостью препаратов?
Экономический аспект, естественно, имеет значение. Но во главу угла ставится здоровье пациента. Это довольно новая группа препаратов, нуждающаяся в крайне аккуратном и выверенном назначении. До первого введения или приема медикамента пациент должен быть детально обследован, необходимо оценить активность заболевания. Необходимо, чтобы это была не субъективная оценка самочувствия, а ряд исследовательских индексов активности. Помимо этого, должна быть доказана неэффективность других лекарственных средств.
Стоит ли приобретать генно-инженерные препараты, не попробовав другие лекарства?
Нет! Это серьезное решение, и принимается оно совместно с врачом — нужно взвесить все «за» и «против».
За генной инженерией будущее, а цитостатики — вчерашний день?
Это совсем не так. Нельзя делить лекарства по принципу «новое — значит надёжное, а старое — неэффективное». Это в корне неверно, а иногда и крайне опасно.
Можно ли принимать такие препараты без заключения ревматолога?
Данная группа средств требует регулярного взаимодействия с ревматологом. Самолечение может привести к огромному количеству проблем, например: отсутствие лекарственного обеспечения, ускользание эффекта, нежелательные побочные явления и обострение скрытых инфекций. Даже несколько инъекций, выполненных без назначения и контроля ревматолога, могут привести к плачевным исходам. Это авантюра, которая в некоторых случаях может привести к летальному исходу. Принимать ГИБП можно лишь по заключению врача, который умеет работать с ними и осуществлять контроль безопасности. Это очень важно.
Запишитесь на консультацию к врачу-ревматологу в медицинский центр «Неббиоло» и получите ответы на все интересующие вас вопросы о генно-инженерной биологической терапии!
Чем ГМО опасны для здоровья?
Ученые уже давно спорят о пользе и вреде генетически модифицированных организмов. Кто-то опасается онкологии, другие предупреждают о высоком риске аллергии. Третьи, напротив, настаивают, что ГМО совершенно безопасны.
Чтобы ускорить процесс, люди придумали селекцию – метод изменения генотипа за счет выборочного скрещивания нужных особей. Например, нужны нам огромные помидоры, значит выбираем семена от растений с наиболее подходящими ягодами, и скрещиваем между собой. Глядишь, что-нибудь да получится.
Но у селекции есть существенный минус – скрещивать мы можем только растения одного вида. А что делать, если такого гена у растений нет? Например, хочется нам, чтобы томаты были не только большие, но еще и хранились долго. Вот задача! «Вставив» в ДНК помидора нужный ген от другого организма (например, бактерии), мы можем получить овощ, который придется не по вкусу бациллам, но понравится человеку.
С помощью модификации генотипа, растения могут получить ген устойчивости к гербицидам, вирусам и насекомым. Все это помогает существенно сократить дозы пестицидов и других вредных веществ, используемых в сельском хозяйстве.
Значит от ГМО только польза?
Не совсем. Ученые очень осторожны в оценке безопасности ГМО. Доказано, что в процессе изменения генотипа организма может повыситься его токсичность или аллергенность.
Например, для производства пищевой добавки триптофана в США в конце 80-х годов была создана генетически модифицированная бактерия. Но вместе с обычным триптофаном, по невыясненной до конца причине, она стала вырабатывать этилен-бис-триптофан. В результате его употребления заболело 5 тысяч человек, из них – 37 человек умерло, а полторы тысячи стали инвалидами.
Сейчас контролю ГМО уделяется особое внимание. В России запрещено выращивать и ввозить ГМО (исключение составляют только научные эксперименты), а в других странах ограничения действуют лишь на некоторые продукты.
В какие продукты добавляют ГМО?
Чаще всего ГМО встречается в продуктах, содержащих сою, так как это растение очень сложно вырастить, если оно не имеет искусственно добавленного гена устойчивости к гербицидам. Поэтому ГМО можно обнаружить, например, в колбасе или сосисках.
ГМО-элементы также присутствуют в некоторых молочных продуктах, хлебе, кондитерских изделиях, майонезе. Есть рыба, выращенная на ГМО-корме.
До 1 июля 2016 года не существовало штрафов за выращивание ГМ-картофеля, кукурузы, риса и свеклы. Но сегодня эти продукты не должны быть на наших прилавках. К сожалению, отличить «на глаз» растения с измененным генотипом не получится. Выявить ГМО поможет только информация на этикетке, но и она не всегда достоверна.
В целом, не все так страшно. Да, ГМО повышает риск аллергии, и может негативно отразиться на здоровье человечества в целом, но все же это не самая большая проблема. Современное сельское хозяйство все построено на достижениях науки, а значит и серьезном вмешательстве в естественное развитие организмов.
Молоко, которое мы пьем – от селекционных коров. Овощи и фрукты на нашем столе тоже выведены с помощью искусственного отбора и с применением химии (пестициды, гербициды). Пожалуй, найти действительно «чистые» продукты в современном мире не представляется возможным, и ГМО на этом фоне кажется не такой уж большой проблемой.
ГМО: мифы и реальность. Вредны ли генно-модифицированные организмы для здоровья?
Генно-модифицированные ДНК и белки
Всех интересует вопрос: несет ли какие-то дополнительные риски для здоровья употребление генно-модифицированных продуктов по сравнению с употреблением обычных продуктов, выведенных методами селекции? Следует отметить, что ГМО-продукты отличаются от обычных наличием генно-модифицированных ДНК и белков, чужеродными для человека.
Считается, что чужеродная ДНК чисто гипотетически может встраиваться в клетки организма или в бактерии, формирующие микробиоту (микрофлору) кишечника. Однако ДНК, попадая в пищеварительный тракт, подвергается расщеплению и теряет свои свойства кодировать белки.
Так, например, в пищеварительный тракт попадает огромное количество чужеродных для человека ДНК рыбы, мяса, растительной пищи. Однако никаких последствий с точки зрения изменения генетических свойств клеток человека или микробиоты кишечника при этом не происходит. Все попытки исследователей доказать, что чужеродная ДНК может встраиваться в геном клеток организма и приводить к продукции чужеродного белка, оказались бесплодными. Также не удалось научно доказать факт попадания такой ДНК в бактерии микробиоты кишечника и изменения их свойств.
Употребление в пищу продуктов, содержащих ГМ-организмы, не несет никаких рисков, что подтверждается результатами научных исследований. Доказанных фактов нанесения вреда здоровью человека или животных от употребления в пищу ГМ-организмов или их продуктов науке неизвестны
Преимущества применения ГМО в сельском хозяйстве
Согласно современным научным представлениям, выращивание ГМ-культур экономически обосновано и безопасно. Разведение ГМ-растений и пород ГМ-животных обладают преимуществами с точки зрения пищевой ценности, увеличения урожая, безопасности продуктов питания, уменьшения использования пестицидов, минимизации влияния антропогенной деятельности на природные экосистемы.
Об этом свидетельствует тот факт, что общая площадь посевов биотехнологических культур в мире составила в 2013 году 175,2 млн. га, что больше всей площади пашенных земель в России. В 2013 году ГМ культуры высевались в 27 странах мира, в том числе 5 странах Евросоюза. В первой десятке по площади посевов находятся США и все страны БРИКС, кроме России. Всего в странах, высевающих генно-модифицированные культуры, проживает 60% населения Земли. В основном выращиваются генетически-модифицированные соя, кукуруза и хлопок, некоторые виды овощей.
По данным Klumper and Qaim (2014), использование ГМ-технологий позволяет увеличить урожайность на 22%, прибыль производителей на 68% на фоне снижения использования пестицидов на 37%. ГМ-растения обладают уникальными свойствами: устойчивостью к вредителям и гербицидам – средствам борьбы с сорняками. Мировое снижение использования гербицидов и инсектицидов в результате внедрения ГМ-технологий составляет 0,2 миллиона тонн в год. Содержание гербицидов в конечной продукции снижается до 10 раз. В результате использования ГМ-культур уменьшается популяция и разнообразие насекомых-вредителей и растений-сорняков в районах сельхозугодий.
Для обеспечения безопасности новых продуктов достаточно существующих санитарных требований. В России действует эффективная система санитарного контроля. Роспортебнадзор проводит государственную регистрацию продуктов с комплексной оценкой рисков и учетом содержания в них ГМО. Оценка безопасности включает молекулярно-генетические исследования, медико-биологическую оценку безопасности, санитарно-эпидемиологическую экспертизу.
Центры гигиены и эпидемиологии во всех субъектах Российской Федерации оснащены высокотехнологичным оборудованием, позволяющим применять скрининговые, качественные и количественные методы определения ГМО растительного происхождения, основанные на молекулярно-биологических технологиях.
Новое оборудование позволяет с максимальной степенью достоверности обнаруживать как линии ГМО, разрешенные к применению в установленном порядке, так и новые линии ГМО 2 поколения, а также генетические вставки, характерные для генетически модифицированных организмов, не зарегистрированных в Российской Федерации.
Комплексную экспертизу Роспортебнадзора на безопасность прошли некоторые ГМ-сорта кукурузы, риса, сои, сахарной свеклы, картофеля. Например, в первом полугодии 2019 года исследовано более 16 тысяч проб пищевой продукции на наличие ГМО.
По результатам исследования Роспотребнадзором, с 1 июля 2019 приостановлен ввоз на территорию Российской Федерации папайи свежей производства Китай, вся продукция отозвана из оборота.
По всем выявленным нарушениям обязательных требований приняты меры административного принуждения в соответствии с Кодексом Российской Федерации об административных правонарушениях, выданы предписания об изъятии продукции, предписания об устранении выявленных нарушений.
Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 022/2011 «Пищевая продукция в части ее маркировки» установлено, что маркировка пищевой продукции должна содержать сведения о наличии в пищевой продукции компонентов, полученных с применением ГМО, при их содержании более 0,9%.
В целях совершенствования системы безопасности и контроля оборота генно-модифицированной продукции Роспотребнадзор ведет постоянную работу по актуализации ранее утвержденных и разработке новых методов и методик исследований пищевой продукции на содержание ГМО.
ГМО и российское законодательство
Выращивание и разведение ГМО – наукоемкая и высокотехнологичная область биотехнологии. Результаты исследований в этой сфере применяются в сельском хозяйстве, производстве инновационных продуктов питания, лекарственных препаратов. Сегодня это один из трендов в биотехнологии, бионанотехнологии и биомедицинских науках. Однако в России на сегодняшний день не разработан регламент государственной регистрации ГМО, поэтому фактически в нашей стране нет разрешения на их производство, хотя разрешен ввоз соответствующей продукции.
Роспотребнадзором в результате лабораторных экспертиз были выявлены незарегистрированные в Российской Федерации линии ГМО, в том числе новых поколений, в 22 пробах пищевой продукции:
1. папайя ананас кусочки 6х6 мм «Премиум», сублимационной сушки, изготовитель «Nantong BrightRanch Foodstuffs» (4 образца), обнаружены генетические маркеры p35S, pNos, tNos, npt II;
2. кусочки папайи в овсяной каше «Быстров» без варки «Ассорти для гурманов» с папайей и ананасом», изготовитель ООО «Нестле Россия» (16 образцов), обнаружены генетические маркеры p35S, pNos, tNos, nptII;
3. папайя свежая, изготовитель «Ning Аn YuanfengEconomic and Trade CO., LTD», Китай, обнаружены генетические маркеры CaMV 35S, FMV 35 S, терминатора NOS, ген nptII.
Эти партии товаров изъяты из оборота в магазинах.Роспотребнадзором продолжается контроль за ГМО в пищевой продукции.
Генная терапия: познакомьтесь с лекарствами будущего
Излечение от ранее неизлечимых болезней уже становится реальностью
Автор
Редакторы
В XX веке медицина и фармацевтика совершили невероятный скачок. Были созданы и внедрены в широкую практику самые разные лекарства — от антибиотиков до первых терапевтических антител, — благодаря чему существенно улучшилось здоровье и самочувствие многих людей, а также выросла средняя продолжительность жизни. Однако прогресс не остановить: доставка нужных генов прямо в клетки и ткани организма или их направленное редактирование позволяют «починить» неисправные молекулярные процессы, что дает в сравнении с традиционной фармацевтикой принципиально новые возможности для терапии ранее неизлечимых болезней. А поскольку технологии не стоят на месте, в будущем генная терапия займет важнейшее место в арсенале медиков.
Генная и клеточная терапии
Спецпроект о генной и клеточной терапиях, тернистом пути их развития, первых успехах и надеждах, а также о сложностях регулирования, производства и изучения этих новейших методов лечения.
Партнер спецпроекта — Департамент разработки генотерапевтических препаратов одной из крупнейших российских биотехнологических компаний — BIOCAD. BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.
От природных экстрактов к появлению передовой терапии
Сегодня мы живем в мире, где доступность лекарств и медицинской помощи является чем-то само собой разумеющимся, и мы редко задумываемся, что так было далеко не всегда. А ведь несмотря на то, что попытки лечения различных недугов предпринимались с древних времен, долгие века борьба с болезнями велась с помощью природных средств или экстрактов из них, компоненты которых подбирались зачастую случайно или на основе умозрительных ложных концепций, а потому всё лечение было весьма сомнительным [1].
Всё стало меняться в начале прошлого столетия, когда развитие химических методов (особенно органического синтеза) подготовило почву для создания самых первых искусственно синтезированных низкомолекулярных лекарств, появление которых ознаменовало начало новой эры в медикаментозной терапии. В дальнейшем промышленное производство этих малых (низкомолекулярных) лекарственных молекул (small-molecule drugs) легло в основу традиционной фармацевтики и дало возможность лечения самых разных болезней, что вывело на новый уровень и медицинскую помощь, идущую сегодня с фармакотерапией рука об руку. Уже во второй половине XX века на рынке появилось множество низкомолекулярных лекарств: различные виды антибиотиков, обезболивающих и противовоспалительных, кардиопротекторов, противоопухолевых препаратов и пр.
Эти лекарства были достаточно эффективными, а возможность их массового применения в конечном счете изменила ландшафт современного лечения. И все же несмотря на очевидные (и, будем честны, для своего времени революционные) преимущества, терапия низкомолекулярными препаратами далеко не универсальна, поскольку ограничивается воздействием малых молекул лишь на некоторые типы лекарственных мишеней (GPCR, ионные каналы, киназы, протеазы и т.д.), что позволяло лечить ограниченный перечень болезней (в патогенезе которых участвуют именно эти биомишени) [3], [4]. Однако сейчас уже известно, что бóльшая часть человеческого протеома (а именно белки являются основными лекарственными мишенями [4]) и вовсе недоступна для воздействия малыми молекулами, поскольку специфические сайты связывания для низкомолекулярных лекарств у этих мишеней отсутствуют [1], [4]. Эти ограничения обусловили недостаток эффективного лечения многих недугов, и создали потребности, остававшиеся неудовлетворенными в течение достаточно длительного периода, — эпохи, когда альтернативы малым лекарственным молекулам просто не было.
Однако в конце второго тысячелетия всё снова изменилось: появились препараты совсем нового типа — лекарства на основе биологических молекул. Биологические лекарства (главным образом моноклональные антитела ) оказались более специфичными и обеспечили возможность «нацеливания» на прежде недоступные мишени (за счет белок-белковых взаимодействий), что привело к появлению новых успешных способов лечения в ревматологии и онкологии. Такие преимущества способствовали более широкому внедрению биопрепаратов, и в скором времени эти лекарства обрели за счет своей эффективности немалую популярность, что уже сегодня позволило им занять значимую долю фармацевтического рынка [1].
Это поистине удивительные молекулы. Узнайте, что это такое, в статье «Моноклональные антитела» [5], а также посмотрите комикс «Открытие моноклональных антител» [6]. Ну а подробнее об их применении в качестве лекарств читайте в публикации «Терапевтические моноклональные антитела» [7] из одноименного цикла.
И всё же, как и малые молекулы, биологические молекулы-лекарства имеют и недостатки, ― антитела, например, не способны из-за своего размера проникать в клетки, и потому их терапевтическое действие ограничивается в основном внеклеточными белками, такими как гормоны, факторы роста, другие антитела, клеточные рецепторы и пр. [8]. Но поскольку наука не стоит на месте, сегодня мы наблюдаем, как медицина и лекарственная терапия смело выходят за рамки традиционной фармацевтики, и на арене клинических исследований появляется всё больше новых терапевтических модальностей, в авангарде которых ― так называемая передовая терапия: генная и клеточная терапии.
Этой статьей мы начинаем спецпроект, который расскажет об истории развития передовой терапии, научных подробностях, лежащих в основе новых разработок и о самых ярких представителях генных и клеточных продуктов. Отдельная статья будет посвящена производству и контролю качества таких препаратов.
В настоящей статье мы сфокусируемся именно на генной терапии, разберем, чем она отличается (и чем схожа) с клеточной терапией, рассмотрим использующиеся технологии, пройдемся по существующим ныне препаратам, а также затронем будущие перспективы и имеющиеся ограничения такого лечения.
Принцип действия: как работает генная терапия
Помимо FDA вторым основным мировым регулятором использования лекарств сегодня является EMA — Европейское агентство лекарственных средств, — и эта организация имеет свое определение генной терапии.
Генная терапия медицинское вмешательство, основанное на модификации генетического материала живых клеток. Клетки могут быть модифицированы ex vivo для последующего введения человеку или изменены in vivo непосредственно в организме [9].
Это определение достаточно точное, но чтобы полностью его понять, необходимо разобраться с принципами используемой в генной терапии технологии (рис. 1) или, проще говоря, понять, как работает такое лечение.
Рисунок 1. Технологии генной терапии: in vivo vs ex vivo. Вариант in vivo означает внедрение вектора, несущего нужный ген, прямо в целевой орган или в непосредственной близости от него (это делается путем инфузии). Эта стратегия сегодня успешно применяется при лечении наследственных заболеваний органов зрения, нервно-мышечных расстройств и гемофилии [10]. В терапии ex vivo определенные клетки (например, гемопоэтические стволовые клетки костного мозга) отбирают у пациента, а затем в культуру этих клеток трансдуцируют векторы, внедряя вместе с ними и терапевтические гены. Размноженные генно-модифицированные клетки трансплантируют обратно пациенту. По этому пути сегодня лечат наследственные метаболические и иммунологические заболевания, а также некоторые онкологические болезни.
Как это работает?
У этого правила есть одно очень известное исключение — китайский ученый Хэ Цзянькуй при помощи системы CRISPR/Cas9 внес изменения в геном полученной путем экстракорпорального оплодотворения зиготы. Зигота была имплантирована обратно женщине, которая родила двух генно-модифицированных девочек, известных под псевдонимами Лулу и Нана. Эксперимент Цзянькуя стал вопиющим нарушением действующих биоэтических и научных норм, а его огласка спровоцировала большой скандал и жаркие дискуссии относительно возможностей подобной модификации людей в современном мире. Подробнее об этом читайте в статье «Биомолекулы»: «Изменение генома и. мировой науки?» [11].
Генная терапия классифицируется также в зависимости от того, вносятся изменения в клетки непосредственно в организме или за его пределами.
Генная терапия in vivo подразумевает внедрение генетического материала напрямую путем инфузии; при этом в организм человека вводят раствор, содержащий определенное количество нужных генов, как правило, заключенных в носители (или векторы — подробнее о них ниже). После этого введенные генетические конструкции достигают клеток-мишеней и, попадая в них, экспрессируются там в соответствующие белковые продукты.
Читатели, для которых загадочно выглядят выражения in vivo и in vitro, соблаговолят ознакомиться с нашей старой заметкой In vivo — in vitro — in silico [13].
Хотя генную и клеточную терапии часто объединяют под термином «передовая терапия», ключевое различие между ними в том, что суть генной терапии состоит в переносе именно генетического материала в клетки организма, в то время как клеточная терапия подразумевает перенос (или трансплантацию) самих клеток с определенной функцией в организм человека. В генной терапии ex vivo объединяются оба этих подхода. За дополнительной информацией насчет того, как работают с клетками, мы отправляем читателя к статье «12 методов в картинках: клеточные технологии» [14] из цикла «12 биологических методов в картинках».
Векторы ― носители для доставки генов
В большинстве случаев в качестве носителей для доставки генов используют вирусы, чья естественная способность внедрять свой генетический материал в клетки хозяина может быть не только вредна, но и полезна. Но всё не так страшно, как кажется: такие вирусы сначала «препарируют» методами генной инженерии, удаляя большинство отвечающих за вирулентность генов, что не позволяет вирусу бесконтрольно делиться и освобождает место для вставки целевого гена, который нужно доставить в клетку. Эти вирусы-носители делают всё то же, что и раньше, но только во благо здоровья пациента: защищают лечебный ген от расщепления ферментами крови, заставляют клетки-мишени захватывать вирус, отделять нуклеиновую кислоту от вирусной частицы и транспортировать ее по месту назначения (как правило, в ядро клетки). Клетка, «словившая» такой вирус, оказывается зараженной ― но только уже не опасной инфекцией, а лечащим болезнь гéном, ― а потому начинает синтезировать новый белок, направляющий клетку по пути излечения (рис. 2).
Рисунок 2. Генная терапия с использованием аденовирусного вектора. Вирус проникает через мембрану клетки, упаковывается во внутриклеточную везикулу, которая затем разрушается. ДНК вируса проникает в ядро, где происходит транскрипция целевого гена.
Несмотря на сегодняшнее преобладание векторов на основе вирусов, гены можно доставлять и другими физическими и химическими методами: генной пушкой, электропорацией, магнетофекцией, сонопорацией, применением различных наночастиц (из кремния, золота, фосфата кальция, липидов) и др. Кроме этого, исследуют и возможность доставки «голых» нуклеиновых кислот (naked RNA и DNA). Такие способы доставки целевых генов теоретически могут иметь преимущества в сравнении с вирусами, поскольку их использование легче сделать массовым (векторы на основе наночастиц, например, значительно проще выпускать в промышленных масштабах), кроме того, риск генотоксичности и иммуногенности здесь потенциально тоже будет низким. Однако пока методы химической доставки генов менее специфичны и точны, чем доставка с помощью вирусов, и потому менее эффективны, а методы физического внедрения генов в клетки не могут применяться в терапии in vivo. До сих пор еще ни одно лекарство на базе невирусных способов доставки генов не было одобрено для использования у людей.
Преимущества и недостатки вирусных векторов для in vivo/ex vivo подходов
В качестве носителей для доставки генов in vivo среди различных вирусных векторов сегодня популярнее всего аденоассоциированные вирусы (adeno-associated virus, AAV). Они непатогенны, могут заражать как делящиеся, так и покоящиеся клетки, и демонстрируют высокую экспрессию. Их можно довольно точно «нацеливать» на определенные органы и ткани, поскольку различные серотипы AAV «одеты» в разные белковые оболочки (капсиды), специфичные к различным типам клеток (рис. 3а). В то же время AAV имеют ограниченную емкость и почти не встраиваются в геном, а при трансдукции активно делящихся клеток генетический материал, доставленный вирусом, постепенно теряется, уменьшает их привлекательность для терапии ex vivo, ведь при такой терапии введенные гены должны стабильно передаваться в ряду клеточных поколений [15].
Рисунок 3. Два самых популярных в генной терапии вирусных вектора. а — Аденоассоциированные вирусные (adeno-associated viral, AAV) векторы преимущественно используются для генной терапии in vivo. Благодаря множеству разработанных для генной терапии серотипов и вариантов капсидов, эти векторы могут быть нацелены на широкий спектр тканей, но имеют ограниченную емкость (всего 5 кб) вирусной ДНК. б — Лентивирусные (lentiviral, LV) векторы могут нести целевой ген размером до 8 кб и используются во многих вариантах генной терапии ex vivo, в частности для переноса в гемопоэтические стволовые клетки. LV можно псевдотипировать внедрением в их капсид белков оболочки других вирусов, что позволяет расширять их природную специфичность для воздействия на более широкий диапазон клеток-мишеней.
Емкость здесь исчисляется в количестве пар оснований целевого гена, умещающихся в данный вектор, а единица их измерения ― килобаза (kb, или кб, — принятое сокращение, означающее одну тысячу пар оснований).
Терапия in vivo же из-за элиминации AAV зачастую требует повторного введения для поддержания необходимого уровня экспрессии целевого гена, что может вызывать иммунный ответ на кодируемые вектором белки. Это потенциально приводит к снижению терапевтического эффекта и появлению побочных эффектов [16].
Напротив, ретровирусные векторы (производные γ-ретровируса или лентивируса) стабильно внедряются в геном, что не только способствует более длительной экспрессии в трансдуцированных клетках, но и обеспечивает репликацию внедренного гена при делении, делая терапевтически функциональным весь свой клеточный клон (или клан?).
Однако это же является и минусом ретровирусных векторов: интеграция в геном может приводить к генотоксичности и мутациям, особенно если вектор вставится в протоонкоген или рядом с ним. Этот процесс, именуемый инсерционным мутагенезом, способен превращать протоонкогены в онкогены, что в свою очередь может стать причиной бесконтрольного деления клеток и их опухолевого перерождения. Риск спровоцировать канцерогенез особенно велик в случае использования γ-ретровирусных векторов на основе вируса мышиного лейкоза (MLV), которые преимущественно интегрируются в транскрипционные регуляторные элементы активных генов. В этой связи более удачным можно назвать решение на базе лентивируса (рис. 3б), продемонстрировавшее в доклинических и клинических исследованиях лучший профиль безопасности и более эффективную доставку целевых генов в клетки [15], [16]. В качестве носителей для доставки генов применяют также аденовирусы, вирусы простого герпеса и некоторые другие (табл. 1).
| Основа вектора | Ретровирус | Лентивирус | Аденовирус | Аденоассоциированный вирус | Вирус простого герпеса |
|---|---|---|---|---|---|
| Тип нуклеиновой кислоты | РНК | РНК | ДНК | ДНК | ДНК |
| Емкость вектора | 8 kb | 8 kb | 8–30 kb | 5 kb | 30 kb |
| Иммунный ответ | незначительный | незначительный | увеличенный | незначительный | незначительный |
| Возможность интеграции в геном | да | да | низкая | низкая | ? |
| Долгосрочная экспрессия | да | да | нет | да | ? |
| Основные преимущества | Репликация внедряемого генетического материала при делении клеток — передача в следующие клеточные генерации (за счет стабильной интеграции в геном). Подходит для ex vivo терапии. | Репликация внедряемого генетического материала при делении клеток — передача в следующие клеточные генерации (за счет стабильной интеграции в геном). Подходит для ex vivo терапии. | Высокая эффективность переноса гена в различные типы тканей | Вызывает незначительные воспалительные реакции, непатогенен | Безопасен, высокая емкость, доступен для in vivo терапии |
Генная терапия сегодня
Сегодня мы как никогда близко к входу в новую эру генной терапии, ведь множество препаратов этого класса для использования по различным показаниям уже находятся на разных стадиях клинических исследований (которых зарегистрировано более двух тысяч) [19]. Тем не менее поскольку генная терапия на пути внедрения в клинику поначалу столкнулась с серьезными препятствиями и неудачами [1], [19], а также в связи с трудоемкостью разработки, для реального лечения пациентов пока одобрено совсем немного таких лекарств. Рассмотрим некоторые из них.
Терапия ex vivo
Стратегия ex vivo позволяет лучше контролировать технологические этапы лечения, использовать меньшие количества векторов (при делении отобранных клеток генетический материал также размножается) и тщательнее избегать генетической модификации нецелевых тканей и органов. Сегодня это решение чаще всего используется для лечения различных заболеваний крови, поскольку в этом случае клеточный материал для модификации довольно легко получить ― путем забора крови или костного мозга [20].
Лечение врожденных иммунологических заболеваний
Strimvelis, первоначально выпущенный GlaxoSmithKline (GSK), был первым продуктом генной терапии ex vivo, получившим одобрение для использования у пациентов в Европе (в 2016 году). Этот препарат предназначен для лечения редкого наследственного заболевания ― дефицита аденозиндезаминазы (ADA) ― наиболее распространенного типа тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) [19]. При такой болезни организм пациентов вырабатывает недостаточно фермента ADA, который важен для формирования здоровых и функциональных лимфоцитов [19]. В результате нормальная пролиферация этих иммунных клеток нарушается, что приводит к патологическим изменениям, иммунодефициту и заражению опасными для жизни оппортунистическими инфекциями [19]. Такая форма SCID очень опасна, и без лечения дети с этой врожденной патологией умирают, как правило, в первый год жизни.
Тем не менее именно с этим заболеванием были связаны самые первые успехи генной терапии, когда еще в начале 1990-х годов у четырехлетней Ашанти Де Сильва отобрали лимфоциты периферической крови, затем модифицировали их гéном, кодирующим функциональный ADA, с использованием γ-ретровирусного вектора, а после размножили и ввели обратно пациентке в полном соответствии с принципами стратегии ex vivo, что и помогло в итоге победить болезнь [1], [19].
Strimvelis, вышедший на рынок спустя более чем полтора десятилетия после этого случая, также использует γ-ретровирусный носитель для доставки целевого гена, однако здесь этот вектор трансдуцируют в гемопоэтические стволовые клетки костного мозга, которые впоследствии, уже после культивирования и введения пациенту, делятся и дифференцируются в организме в зрелые лимфоциты, продуцирующие нормальный фермент ADA [19].
Несмотря на то, что Strimvelis показал эффективность в лечении дефицита аденозиндезаминазы, для GSK он, по всей видимости, оказался не вполне рентабельным, поскольку в марте 2018 года этот фармгигант продал препарат компании Orchard Therapeutics, успев пролечить только пятерых пациентов.
Лечение врожденных болезней системы кроветворения
Zynteglo ― препарат для лечения врожденного заболевания крови, известного как β-талассемия ― недуг, при котором у пациентов снижается способность вырабатывать гемоглобин (белок в красных кровяных клетках, доставляющий с током крови кислород к органам и тканям, недостаток которого при этом заболевании приводит к опасной анемии). Причина патологии ― дефект в кодирующем β-цепь гемоглобина гене, и именно его «рабочий» вариант внедряют при помощи лентивирусного вектора при терапии с помощи препарата Zynteglo. При этом, как и в случае с Strimvelis, трансдуцируют вектор в предварительно отобранные у пациента гемопоэтические стволовые клетки, которые после введения обратно в организм дифференцируются в уже здоровые эритроциты, несущие функциональный гемоглобин.
Препарат Zynteglo будет производить биотехнологическая компания Bluebird Bio, получившая в мае 2019 года условное одобрение на его продажу от Европейского медицинского агентства. Этот препарат может стать хорошим решением для пациентов с тяжелой формой β-талассемии, ведь им приходится постоянно переливать кровь, а Zynteglo, как предполагалось, может всего за одну инъекцию избавить от пожизненной необходимости в гемотрансфузиях. Однако клинические исследования показали, что такая эффективность достигается далеко не всегда: от необходимости в переливаниях избавились 80% пациентов с менее тяжелой формой β-талассемии, в то время как для больных с более тяжелой формой недуга этот показатель составил только 38%.
После получения одобрения Bluebird Bio заявили, что отложат коммерческое лечение препаратом минимум на несколько месяцев из-за производственных проблем, но по последним данным, сейчас уже для выпуска лекарства всё готово, и в компании надеются приступить к терапии первых пациентов в течение первой половины 2020 года.
Лечение онкогематологических заболеваний T-клетками с химерными рецепторами антигена (CAR-T)
Для лечения некоторых онкогематологических заболеваний сегодня успешно применяют терапию генномодифицированными T-клетками с химерными рецепторами антигена (chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T). Преимущества этого лечения связаны с использованием и усилением естественного биологического механизма защиты организма от периодически появляющихся злокачественных клеток (иммунного противоопухолевого ответа) (рис. 4) [21].
Рисунок 4. При применении CAR-T иммунные T-лимфоциты извлекают у пациента, модифицируют внедрением кодирующего особый химерный рецептор гена, после чего размножают. Измененные лимфоциты, теперь уже экспонирующие на своей поверхности требуемый рецептор, вводят больному. Такая модификация позволяет T-клеткам с усиленной специфичностью находить и уничтожать опухолевые клетки, что и обусловливает терапевтический успех этого лечения.
Этот иммунотерапевтический подход начали разрабатывать еще в конце далеких 1980-х, а уже в 2010-х проводили первые испытания CAR-T-терапии у страдающих гемобластозами пациентов, что смогло тогда привлечь широкое внимание прессы и общественности, ведь была продемонстрирована заметная эффективность в лечении прогрессирующих форм этих заболеваний (вплоть до полной ремиссии в течение времени наблюдения) [1], [22].
Затем (в 2017–2018 годах) были одобрены для использования сначала в США, а потом и в Европе два использующих технологию CAR-T препарата: Kymriah от Novartis и Yescarta от Gilead. Оба они представляют собой генетически модифицированные аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный рецептор, и способные распознавать опухолевые бласты по содержащимся на их поверхности антигенам CD19 с последующим лизисом таких клеток. При этом такие лекарства различаются векторами, используемыми для внедрения гена, кодирующего химерный рецептор: в Kymriah — это лентивирусный вектор, а в Yescarta — γ-ретровирусный [23].
Стоит отметить, что, помимо заметной терапевтической эффективности, использование технологии CAR-T связано с серьезными опасными (потенциально даже смертельными) побочными эффектами. Вызывает вопросы и долгосрочность эффектов Kymriah и Yescarta, поскольку есть данные о возникающих спустя некоторое время после лечения этими препаратами рецидивах заболеваний и снижении терапевтических эффектов [23].
И все же, поскольку терапия T-клетками с химерными рецепторами антигена может явить чудо и вернуть к жизни безнадежных пациентов, не возникает никаких сомнений в жизненной необходимости разработки этого лечения.
В России применением CAR-T на базе НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева занимается группа под руководством Михаила Масчана. После переноса технологии в центр в феврале 2018 года началось лечение пациентов, и за два года терапию прошли 46 пациентов, из них 27 — в рамках клинического исследования. Все пациенты были с тяжелым опасным заболеванием — В-клеточным острым лимфобластным лейкозом, устойчивым к предшествующей терапии. Цикл производства клеточного продукта составлял примерно 28 дней. Полная ремиссия достигнута у 87% пациентов — это потрясающий результат, учитывая, что при обычной терапии доля отвечающих пациентов не превышает 10%.
Самой большой проблемой, по словам Масчана, оказалось ускользание опухоли от CAR-T из-за потери антигена CD19, и в ближайшем будущем он надеется получить доступ к CAR-T двойной специфичности — CD19/22, — которые должны снизить вероятность рецидива опухоли, а также приступить к исследованию анти-GD2 CAR-T против нейробластомы.
Отчет по этому исследованию Михаил Масчан представлял на конференции Biotechclub-2019 и на ряде международных конгрессов.
Терапия in vivo
Лечение in vivo в перспективе может позволить охватить более широкий спектр заболеваний, чем терапия ex vivo (поскольку не все клетки столь же доступны для культивирования in vitro с последующим внедрением пациенту, как клетки крови). Однако пока эта технология в целом менее отработана, что во многом связано с особенностями используемых для доставки генов векторов. Впрочем, вывод на рынок препаратов для генной терапии in vivo в последние годы отражает улучшения в разработке таких носителей.
Первый блин комом
Glybera компании uniQure стала первым генотерапевтическим препаратом, зарегистрированным в Европейском союзе еще в 2012 году. Она представляет собой вирусный вектор AAV1, несущий нормальную копию гена липопротеинлипазы (LPL) для лечения недостаточности LPL — редкого генетического заболевания, при котором из-за дефекта в гене LPL у пациентов накапливаются триглицериды и возникает тяжелый панкреатит.
На Glybera была установлена очень высокая цена — 1,6 млн долларов, позже сниженная до 1 млн. Продукт ожидал коммерческий провал из-за очень небольшого количества пациентов (за первый год пролечили ровно одного пациента), сложностей с производством и наличием альтернативы в виде контроля жиров в пище и крови. Компания не стала регистрировать продукт в США и вывела его с рынка в Европе.
Несмотря на неудачу, uniQure смогла использовать накопленный опыт, и продолжать разработки в области генной терапии — ее продукт для лечения гемофилии В находится в третьей фазе клинических исследований [10].
Лечение наследственной дистрофии сетчатки
Luxturna, выпускаемая Spark Therapeutics, ― первый препарат генной терапии in vivo, получивший одобрение для использования в США (в 2017 году). Это лекарство предназначается для лечения редкой формы наследственной слепоты, вызываемой биаллельной мутацией (повреждением обеих копий гена) гена RPE65. Из-за таких генетических изменений возникает дефицит кодируемых RPE65 изомераз ― особых ферментов, специфичных для пигментного эпителия сетчатки и критически важных для нормального зрения. Недостаток этих ферментов приводит к нарушению функции светочувствительных клеток и их постепенному отмиранию, что, в свою очередь, вызывает прогрессирующее ухудшение зрения, способное дойти даже до полной слепоты. Это выражается в симптомах наследственных заболеваний, известных как амавроз Лебера типа 2, пигментный ретинит типа 20, а также некоторых форм ранней дистрофии сетчатки [19].
Терапия препаратом Luxturna заключается в однократной инъекции прямо под сетчатку (то есть субретинально) раствора, содержащего AAV-векторы с нормальной копией гена RPE65. Такое введение обеспечивает проникновение AAV с целевыми генами в расположенные под сетчаткой клетки пигментного эпителия и длительную экспрессию в них. Этому способствует «закрытость» глаза как системы, благодаря которой векторы, во-первых, меньше элиминируются, а во-вторых «прикрыты» от клеток иммунной системы, что не позволяет организму вырабатывать антительный ответ против них, снижая тем самым их эффективность как носителей для доставки генов [1].
В клинических исследованиях препарата Luxturna было показано достоверное улучшение зрения, при этом известная долговременность устойчивого ответа на терапию на данный момент составляет четыре года, что немаловажно, ведь это лекарство, как и прочие из арсенала генной терапии ― совсем недешево (450 тыс. долларов за инъекцию каждого глаза).
Работающий пример генной терапии in vivo
Zolgensma ― сейчас самое дорогое лекарство в мире (стоимостью 2,1 миллиона долларов). Выпускаемое компанией Novartis, это средство предназначено для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) — редкого наследственного нейродегенеративного заболевания, которым, однако, страдает примерно 1 из 10 000 человек [24].
Причиной заболевания является врожденный дефект в гене SMN1, кодирующем соответствующий белок, участвующий в поддержании двигательных (моторных) нейронов в «живом» и нормально функционирующем состоянии. При недостатке или отсутствии белка SMN1 двигательные нейроны отмирают, что приводит к ослаблению мышц, а затем и их атрофии, что происходит при заболевании SMA. В конечном итоге усиление симптомов перерастает в неспособность контролировать даже самые простые движения, включая дыхание и глотание, что без лечения может привести к трагическому исходу.
Zolgensma вводят путем инфузии раствора с векторами AAV серотипа 9 (AAV9), содержащими функциональную копию гена SMN1. Доставка этого гена в двигательные нейроны приводит к биосинтезу активного белка SMN, что и обеспечивает терапевтический эффект, нивелируя врожденный недостаток этого белка.
Данные клинических исследований на сентябрь 2019 года показывают, что максимальный срок наблюдения за пациентами составил 4,6 лет, некоторые из них начинают самостоятельно стоять и ходить [25]. Это очень хороший показатель, ведь исторически известно, что вообще без лечения выживаемость с этой болезнью в течение двух лет не превышает 8%.
Однако при такой терапии были зафиксированы и нежелательные явления, в том числе серьезные; сообщается даже об одном летальном исходе, правда пока до конца неясно, было ли это непосредственно вызвано использованием препарата [26].
Тем не менее, поскольку это лекарство дает надежду на жизнь людям, страдающим страшной смертельной болезнью, его появление можно считать настоящим прорывом, и хочется верить, что с возможными токсическими эффектами удастся справиться.
Онколитический вирус
Imlygic от Amgen ― это препарат совершенно иного типа, чем рассмотренные выше, поскольку вирус (а именно генетически модифицированный вирус простого герпеса) здесь используется не просто для доставки целевого гена, но сам по себе является терапевтическим агентом, вызывая, с одной стороны, гибель инфицированных им опухолевых клеток, а с другой — активируя иммунную систему на борьбу со злокачественным заболеванием (рис. 5).
Рисунок 5. Imlygic — генетически модифицированный вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) с онколитическими свойствами. Удаление гена ICP47 обеспечивает презентацию антигена, а также позволяет вирусу расти и размножаться в опухолевых клетках. Последовательность, кодирующая нейровирулентность, заменена колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF). Это способствует активности дендритных клеток и увеличению презентации опухолевого антигена, что может привести к более устойчивому системному ответу за счет активации цитотоксических Т-клеток [27].
Это лекарство — первое и пока единственное в классе препаратов на основе онколитических вирусов, получившее одобрение для применения у людей (в США, Европе и Австралии [28]) и используется для лечения меланомы — агрессивного и смертельно опасного злокачественного заболевания кожи, уносящего тысячи жизней ежегодно [27].
Одобрение Imlygic — важный прецедент для генной терапии, но революцию препарат не совершил: он показал довольно скромную эффективность по сравнению с группой сравнения (GM-CSF) [29]; вводится прямо в опухоль, что неудобно и не всегда возможно; и явно уступает по широте использования ингибиторам контрольных точек иммунного ответа [30], которые вышли на рынок в то же время.
В последнее время исследуются возможности усиления терапии Imlygic комбинированием с другими иммунотерапевтическими препаратами, в частности с ингибиторами контрольных точек иммунного ответа [29], [31], [32]. В перспективе это может создать более эффективное лечение, закрепив тем самым важную роль препарата Imlygic в качестве иммунотерапевтической стратегии для лечения прогрессирующей меланомы.
Взгляд в будущее
Генная терапия с использованием вирусных векторов будет, безусловно, улучшаться и дальше, и мы увидим новые препараты на основе этой технологии в клинике. Однако существуют решения, теоретически способные усилить потенциал генной терапии, что, возможно, в будущем сделает ее не только гораздо безопаснее и эффективнее, но и применимой при более распространенных заболеваниях (впрочем, пока до таких достижений далековато, не будем сильно забегать вперед).
Дело в том, что CRISPR/Cas9 далеко не первая и не единственная система для геномного редактирования на основе эндонуклеаз, и еще до нее для этой цели применяли, например, такие системы как TALEN (transcription activator-like effector nucleases) и ZFN (zinc-finger nucleases), причем эти инструменты исследуются до сих пор, и некоторые эксперты отмечают их преимущества перед CRISPR как более точных [36–38]. TALEN уже исследуется компанией компанией Cellectis в клинике для лечения гемобластозов [39]. Однако система CRISPR/Cas9 может оказаться ближе к внедрению в медицинскую практику, поскольку оказалась более простой, готовой к применению и экономически эффективной, ведь ZFN и TALEN зачастую требуют конструирования de novo белка-фермента для специфичного разрезания тех или иных последовательностей ДНК (что долго, дорого и сложно), в то время как CRISPR более универсален: при помощи направляющей РНК (которую гораздо проще и дешевле синтезировать) фермент Cas9 можно нацелить на любые ДНК-последовательности, что, очевидно, во многом и обеспечило более активное внедрение CRISPR/Cas9 в клинику. О других сравнительных характеристиках эндонуклеазных систем геномного редактирования можно прочесть в статье: «12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники» [40].
CRISPR/Cas9: как это работает и немного истории «бактериального иммунитета»
Еще в 1980-е годы ученые смогли идентифицировать в геноме бактерии Escherichia coli область с необычным паттерном, в котором повторяющиеся последовательности ДНК чередовались с высоко вариабельными последовательностями с неизвестной функцией.
Прошло время, и в 2005 году предположили, что эти вариабельные последовательности имеют небактериальное происхождение и осуществляют функцию «иммунной памяти», которая, как позже было доказано, позволяет бактериям «узнавать» встреченные ранее фаги и плазмиды и уничтожать их путем запуска системы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) и Cas (CRISPR associated proteins). Это своего рода «молекулярные ножницы», способные специфически разрезать в узнанных нуклеотидных последовательностях геномы проникших в бактерию патогенов, уничтожая их и защищая тем самым микробную клетку. Расщепленный на фрагменты инвазивный генетический материал затем интегрируется в собственную ДНК бактерии, что и позволяет ей впоследствии быть начеку, и узнавать по геному новые чужеродные агенты [41]. Подробнее можно прочесть в статье «CRISPR-системы: иммунизация прокариот» [33].
Именно на основе этого естественного механизма и была разработана методика CRISPR, позволяющая вносить изменения в геном любого организма с помощью трех основных молекул: нуклеазы Cas9, ответственной за расщепление двухцепочечной ДНК; направляющей РНК, нацеливающей комплекс на нужную генетическую последовательность; и матричной ДНК, используемой для репарации геномной ДНК путем гомологичной рекомбинации — одного из двух способов восстановления двунитевых разрывов, возникающих при расщеплении целевой нуклеиновой кислоты ферментом Cas9. Другой способ — негомологичное соединение концов (NHEJ) (рис. 6).
Рисунок 6. Система CRISPR/Cas-9. Техника включает в основном три молекулы: одну нуклеазу (часто Cas-9 дикого типа из бактерии Streptococcus pyogenes), направляющую РНК и матричную ДНК. Направляющая РНК «распознает» и связывается по принципу комплементарности с нужным участком геномной ДНК и нацеливает на него нуклеазу Cas-9, которая и расщепляет в этом локусе целевую нуклеиновую кислоту. Образовавшийся двунитевый разрыв может быть затем репарирован при помощи синтезированной исследователями матричной ДНК — кстати, именно этот вариант репарации (гомологичная рекомбинация) может быть использован при необходимости внести в геномную ДНК какие-либо новые последовательности.
На что способен CRISPR?
Последовательности нуклеотидов в направляющих РНК могут быть заменены на какие угодно, что позволяет нацеливать эндонуклеазы Cas-9 на любые геномные ДНК-последовательности для направленного редактирования [42]. Подходы на основе вирусных векторов не способны отредактировать конкретную последовательность в геноме, не затрагивая другие его области. Векторы обеспечивают случайную интеграцию своего генетического материала в геном, что, как мы писали, может вызывать инсерционный канцерогенез. «Программируемые» Cas9-нуклеазы способны на гораздо более аккуратную «инженерию», что потенциально позволит им занять лидирующие позиции в генной терапии, поскольку точечное редактирование позволяет проводить самые разные манипуляции с геномной ДНК (такие как активация/инактивация определенных генов, удаление нуклеотидных последовательностей, замена элементов и др.) [43]. Кроме того, такая точность может позволить свести к минимуму возможность случайной вставки генного материала в нецелевой участок с последующими нежелательными эффектами. Сейчас, правда, CRISPR еще не настолько эффективен и безопасен, как хотелось бы, из-за определенных технических сложностей — об этом ниже. Главные опасения вызывает риск неспецифического редактирования (в «не тех геномных локусах»), способного привести к нежелательным мутациям, нарушающим функции каких-либо важных генов и стабильность генома в целом, что потенциально может привести к канцерогенезу.
И хотя сейчас ученые активно работают над улучшением точности нацеливания CRISPR на нужные генетические последовательности [36], дискуссии о потенциальной опасности использования этой системы не утихают — ввиду недостаточной изученности этой пока еще очень молодой технологии. В этой связи пока рано говорить о широком внедрении CRISPR в медицину, однако нельзя не отметить заманчивые перспективы:
CRISPR-технологии в клинических исследованиях
Таких исследований пока совсем немного, но зато они небезуспешны и дают надежду на создание эффективных CRISPR-протоколов в будущем. Рассмотрим некоторые примеры.
Лечение серповидноклеточной анемии и β-талассемии ex vivo
Серповидноклеточная анемия — болезнь, при которой в результате точечной мутации гемоглобина изменяется внешний вид эритроцитов (они начинают напоминать по форме серп); при этом у таких клеток нарушена функциональность — они с трудом циркулируют в сосудах, агрегируют и закупоривают капилляры, что приводит к эпизодам сильной боли — кризам, часто непредсказуемым и значительно ухудшающим качество жизни пациентов. Кроме того, как и при β-талассемии, у больных SCD может развиться анемия ввиду нарушения нормальной доставки кислорода к жизненно важным органам и тканям.
β-талассемию и SCD объединяет то, что обе эти болезни возникают из-за мутаций в гене β-цепи гемоглобина, что нарушает эффективный перенос кислорода клетками крови. Исправление этих мутаций в гемопоэтических стволовых клетках пациента теоретически позволяет достигнуть достаточного для устранения последствий врожденной патологии уровня функционального гемоглобина.
Однако подобное изменение генома с использованием системы CRISPR сейчас осуществить хоть и можно, но ввиду недостаточной отработанности технологии это будет не очень эффективно. Дело в том, что вставка/замена каких-либо фрагментов в геномной ДНК требует использование третьего компонента CRISPR-системы: матричной ДНК, что часто приводит к снижению скорости эффективного редактирования. Чтобы преодолеть это ограничение, исследователи пошли на ухищрение: вместо исправления дефекта ДНК, приводящего к нарушению биосинтеза нормального гемоглобина, они изменили геном в клетках таким образом, чтобы они смогли вырабатывать совсем другую форму этого хромопротеина — фетальный гемоглобин.
Фетальный гемоглобин — это плодный (или внутриутробный) белок, и каждый из нас рождается с его высоким уровнем, однако он преимущественно заменяется взрослым гемоглобином к трем месяцем жизни (тут-то и начинают проявляться симптомы SCD и β-талассемии). Подавление выработки фетального гемоглобина регулируется на генетическом уровне, однако существует одна редкая мутация, способная продлить его продукцию и у взрослых, что может нивелировать проявления β-талассемии и SCD у больных людей.
Терапия CTX001, разработанная CRISPR Therapeutics и Vertex, имитирует эффект этой самой мутации, «выводя из строя» ген BCL11A, кодирующий соответствующий белок-репрессор, в норме блокирующий синтез фетального гемоглобина у взрослых (рис. 7). Выключение гена BCL11A при этом осуществляется при помощи CRISPR в отобранных гемопоэтических стволовых клетках пациентов, что является частью уже хорошо знакомого нам протокола генной терапии ex vivo.
Рисунок 7. Как работает «генетическое лекарство» CTX001. Слева: мутация в гене гемоглобина приводит к его агрегации. Справа вверху: исправление мутации в гене самого гемоглобина. Справа внизу: выключение гена белка-репрессора BCL11A.
Клинические данные по лечению с помощью CTX001 пока имеются только для двух пациентов (по одному на каждую болезнь), а значит, далеко идущие выводы делать еще рановато. И все же, полученные результаты выглядят воодушевляющими:
В дальнейшем CRISPR Therapeutics и Vertex планируют продолжение исследований терапии CTX001, и следующим этапом должно стать испытание этого лечения уже на 45 пациентах.
Лечение амавроза Лебера 10 типа (in vivo)
Амавроз Лебера (Leber’s congenital amaurosis, LCA) — группа наследственных заболеваний сетчатки глаза, которые приводят к ослаблению зрения или слепоте. Различают несколько фенотипов LCA и несколько ответственных за их возникновение мутаций. LCA 10, например, вызывается мутацией в гене CEP290, но этот ген слишком велик, чтобы его функциональную копию можно было бы доставить, «запаковав» в вирусный вектор, а потому и лечение этой болезни с помощью стандартной генной терапии на данном этапе невозможно (в отличие от LCA 2, который можно лечить упомянутым выше препаратом Luxturna).
Пока что разглашается мало деталей об этом исследовании — ничего не сообщается ни о пациенте, ни о том, когда прошла операция, однако некоторые подробности все же стали известны.
Больному субретинально вводили жидкость, содержащую препарат на основе CRISPR, который должен «разрезать» ДНК по обе стороны от мутации, тем самым удаляя ее, что по задумке должно восстановить нормальную работу гена, а значит и вернуть утраченное зрение (или значительно улучшить ухудшившееся).
Сейчас неясно, будет ли такая терапия эффективной, но при положительном результате специалисты компаний, разработавших это лечение (Editas Medicine и Allergan), планируют опробовать его еще на 18 пациентах. В случае дальнейшего успеха, эта первая ласточка в in vivo CRISPR-терапии может проложить дорогу для внедрения подобных препаратов и, хотя еще очень рано об этом говорить, — стать первой вехой, открывающей новую эру более точного и эффективного генного лечения.
Prime editing — прорыв в генном редактировании?
CRISPR ― технология многообещающая, хотя и не доведенная пока до совершенства. Усилия исследователей по ее улучшению привели к созданию нового варианта этой системы редактирования генома, названного prime editing и разработанного специалистами Гарвардского университета. Эта более точная технология позволяет осуществлять истинное редактирование: вырезать и вставлять в геном требуемые ДНК-последовательности или отдельные нуклеотиды (то есть исправлять и точечные мутации).
Одна из ключевых особенностей этой техники заключается во «вписывании» в нужный геномный локус целевой ДНК-последовательности при помощи фермента обратной транскриптазы, «позаимствованного» исследователями у вирусов. При этом специальная РНК для праймированного редактирования (prime editing extended guide RNA, pegRNA) не только направляет весь комплекс на участок, содержащий исправляемый ДНК-локус, но и кодирует информацию о последовательности, которую нужно «вписать» в геном (рис. 8).
Рисунок 8. Принцип prime editing. Гибридный фермент, состоящий из каталитически ослабленного Cas9 (способного расщеплять только одну из цепей ДНК) и обратной транскриптазы, связывается с ДНК и расплетает ее в целевом участке. После того как модифицированный Cas9 расщепляет одну из нитей ДНК, с ней комплементарно связывается свободный участок pegRNA, а затем обратная транскриптаза начинает синтез по матрице РНК целевой нуклеотидной последовательности, достраивая тем самым «оборванную» нить ДНК новым геном. Это приводит к тому, что в какой-то момент в геномной ДНК оказывается две цепи, — одна отредактированная (с новой последовательностью нуклеотидов), и другая — исходная (со старой последовательностью). Это несоответствие запускает систему репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, что в свою очередь приводит к одному из двух результатов:
В оригинальную систему позже ввели изменения для повышения вероятности редактирования.
На текущий момент prime editing показал себя как замечательно точный инструмент генной модификации — в исследованиях с использованием этой технологии нецелевое редактирование составило менее 10%, и менее десятой же части отредактированных клеток имели нежелательные изменения в геноме (в сравнении с 90% при использовании систем CRISPR первого поколения) [46]. Этой точности недостаточно для in vivo редактирования, но вполне достаточно для ex vivo, когда существует возможность отобрать правильно отредактированные клоны.
Стоит сказать, что, помимо точности, prime editing еще и удивительно универсален. Ведь ранее для каждого из типов редактирования (удаления генов, вставки новых последовательностей или замены отдельных нуклеотидов в генетическом коде) требовался свой отдельный тип CRISPR, ну а prime editing может выполнить любую из этих операций. Уже сейчас это означает, что для постановки эффективных экспериментов по генному редактированию может быть использован более простой и рациональный дизайн, ну а при внедрении инструмента в терапевтическую практику это, очевидно, будет еще и проще и дешевле.
Правда, пока prime editing очень мало изучен, ведь исследования проводили только в различных типах культивируемых клеток, и полученных данных еще совершенно недостаточно, чтобы предсказать поведение на людях. Тем не менее заметные уже сейчас значительные преимущества этой версии CRISPR могут стимулировать проведение дальнейших исследований, а в случае положительных результатов — ускорить процесс перехода этого инструмента в клинику [46–48].
Недостатки генной терапии
Технологии генной терапии находятся в самом начале пути, поэтому, естественно, у них много «детских болезней» и огромный простор для улучшения. Ниже перечислены основные задачи, которые требуют решения:
Однако это не только проблемы: это также и потенциальные «точки роста» для новой технологии, где новые идеи получают шанс реализоваться в виде ощутимого преимущества.
Мнение эксперта
Интервью Александра Прокофьева «Биомолекуле»
Александр Прокофьев — заместитель директора департамента разработки генотерапевтических препаратов (направление разработки продукта) компании BIOCAD, доцент кафедры технологии рекомбинантных белков в Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете (СПХФУ), кандидат биологических наук, Ph.D. Александр отвечает за разработку технологий для создания генотерапевтических препаратов для in vivo и ex vivo генной терапии. На данный момент Александр принимает непосредственное участие в разработке первых в России генотерапевтических препаратов на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов для лечения неизлечимых наследственных генетических заболеваний («Это мы занимаемся генетикой: кто в Петербурге изучает генные мутации и разрабатывает лекарства против наследственных заболеваний»).
Сегодня генная терапия является высокоэффективным подходом для лечения тяжелых неизлечимых наследственных заболеваний, связанных с нарушением функции конкретных генов. Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) признаны одним из наиболее удобных инструментов для in vivo генной терапии наследственных заболеваний [49–56], что обусловлено целым рядом преимуществ данной системы доставки терапевтических генов.
Во-первых, rAAV не связаны с патогенезом каких-либо заболеваний у человека.
Во-вторых, rAAV обладают довольно низкой иммуногенностью по сравнению с другими известными вирусными векторами.
Кроме того, поскольку рекомбинантные AAV не содержат вирусных генов, необходимых для репликации и сборки вируса, rAAV являются безопасной системой доставки для генной терапии in vivo [52], [55].
Важно отметить, что многообразие серотипов AAV позволяет получить векторы различного тропизма и профиля иммуногенности. Тканевый тропизм природных серотипов AAV достаточно хорошо изучен, что позволяет выбирать наиболее удобный природный серотип AAV для таргетирования соответствующей ткани. Кроме того, современные подходы к моделированию белковых структур позволяют создавать новые, синтетические генно-инженерные виды AAV-капсидов с желаемой специфичностью к определенной ткани, что позволяет, в том числе, снизить возможный побочный эффект при генной терапии [55], [56].
Сегодня зарегистрировано уже более 200 клинических исследований в мире с применением rAAV как инструмента для генной терапии. На данный момент векторы на основе rAAV занимают лидирующее место в технологии генной терапии in vivo. Первый продукт на основе rAAV, препарат компании uniQure, одобрен ЕМА для лечения дефицита липопротеинлипазы в 2012 году. Пятью годами позже был одобрен препарат Luxturna компании Spark Therapeutics для лечения RPE65-ассоциированной ретинальной дистрофии. В мае 2019 года FDA одобрило генотерапевтический препарат Zolgensma компании Novartis, предназначенный для лечения детей со спинальной мышечной атрофией (СМА) [57–60]. В ближайшие годы ожидается регистрация еще целого ряда генотерапевтических препаратов для лечения неизлечимых заболеваний, в том числе и разработанных в России.
«Биомолекула» задала Александру Прокофьеву вопросы о современном состоянии генотерапевтических продуктов.
«БМ» : Какие заболевания, помимо моногенетических, можно будет лечить генной терапией (in vivo и ex vivo)? Какие перспективы широкого внедрения генных препаратов — за пределами орфанных заболеваний?
АП: Помимо лечения редких моногенных наследственных заболеваний генотерапевтические подходы уже сейчас применяют и для лечения онкологических заболеваний. Так, например, недавно одобрели первые генотерапевтические препараты на основе модифицированных Т-клеток человек (CAR-T-терапия) для лечения онкогематологических заболеваний (Kymriah от компании Novartis; Yesсarta от Kite Pharma/Gilead). В более широком смысле рекомбинантные вирусные векторы имеют множество потенциальных областей применения. С помощью вирусной системы доставки в организм человека можно доставлять различные трансгены. Это могут быть, например, последовательности, кодирующие высокоиммуногенные пептиды для создания векторных вакцин против инфекционных, вирусных заболеваний, в том числе, SARS-CoV-2. Возможно, дальнейшее развитие технологии получения инженерных вирусных векторов подстегнет новую волну интереса к разработкам в области онковакцин и онколитических вирусов.
«БМ» : Готова ли индустрия к производству большого количества доз, есть ли подходы к масштабированию и удешевлению технологии? Готовы ли методики производства к массовому выпуску таких препаратов, если им будет найдено массовое применение?
АП: Мировая фарминдустрия готова к производству генотерапевтических препаратов и со временем их количество и объемы поставок будут только увеличиваться. Надо признать, что сейчас единые стандарты качества в этой области биотехнологии еще не успели сформироваться. Производство генотерапевтических препаратов по-прежнему остается крайне сложным и дорогостоящим процессом. Однако помимо уже существующих компаний, которые занимаются полным циклом разработки генотерапевтических лекарственных препаратов, на рынке начинает появляться все больше контрактных производителей рекомбинантных вирусных векторов. Вполне вероятно, что в ближайшие годы нас ждет настоящий расцвет генотерапии.
Материал предоставлен партнёром — Департаментом разработки генотерапевтических препаратов компании BIOCAD
Луч оптимизма лекарствам будущего
Итак, генная терапия всё больше входит в клиническую практику, и чем дальше — тем больше. Эксперты FDA прогнозируют, что уже к середине 2020-х годов это ведомство будет одобрять в год от 10 до 20 препаратов генной и клеточной терапий, что, очевидно, позволит закрыть многие неудовлетворенные потребности и даст надежду людям с ранее неизлечимыми заболеваниями.
У этих новых и прогрессивных методов есть потенциал, чтобы помочь при самых разных болезнях, но практически генная терапия уже проявила себя в лечении онкологических и моногенных наследственных заболеваний. И здесь кроется один из самых сложных и пока не принятых вызовов: очень часто мы просто не знаем, какие именно гены и каким образом влияют на развитие тех или иных болезней. А потому и направлено такое лечение сейчас главным образом на заболевания, генетические дефекты в которых — яснее некуда.
Подытоживая, отметим, что генотерапевтические подходы находятся в самом начале пути, хотя последние несколько лет и были для генной терапии крайне удачными: одобрены достаточно разноплановые лекарства этого класса, начались сотни клинических исследований, заключены крупные сделки по покупке таких активов компаниями из разряда «Бигфармы» (что подталкивает к дальнейшему развитию этой области). Новые методы лечения, основанные на внедрении функциональных генов (или даже на полноценном редактировании генома), способны кардинально изменить существующие терапевтические стратегии и обеспечить эффективную помощь при многих ныне «безнадежных» заболеваниях.