пцр с обратной транскрипцией в клинической практике используется для

ПЦР с обратной транскрипцией

В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction ) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR ). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК). [1]

Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription ) в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени (англ. Real-time PCR, Q-PCR ), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR. [2]

Содержание

Описание метода

Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу:

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности. [2]

Применение

ОТ-ПЦР обычно используется при изучении вируса иммунодефицита человека, так как ВИЧ является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase ) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.

Примечания

Литература

См. также

Полезное

Смотреть что такое «ПЦР с обратной транскрипцией» в других словарях:

ПЦР — Запрос «ПЦР» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой… … Википедия

Полимеразная цепная реакция — (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо амплификации ДНК, ПЦР… … Википедия

Полимеразная цепная — Запрос «ПЦР» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой… … Википедия

Хронический миелобластный лейкоз — Филадельфийская хромосома, флюоресцентная гибридизация in situ … Википедия

Обратная транскрипция — Обратная транскрипция это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно… … Википедия

Клинические стадии ВИЧ/СПИДа по В.И. Покровскому — Запрос «СПИД» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Синдром приобретённого иммунного дефицита Красная ленточка символ солидарности с ВИЧ положительными и пациентами, у которых развился СПИД МКБ 10 B … Википедия

Обратная транскриптаза ВИЧ — Обратная транскрипция это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так передача генетической информации при этом происходит в «обратном» направлении, относительно… … Википедия

СПИД — Запрос «СПИД» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Синдром приобретённого иммунного дефицита Красная ленточка символ солидарности с ВИЧ положительными и пациентами, у которых развился СПИД МКБ 10 B … Википедия

Источник

Обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции ( ОТ-ПЦР ) является лабораторная методика комбинирования обратной транскрипции из РНК в ДНК (в этом контексте называется комплементарной ДНК или кДНК) и амплификации специфических мишеней ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он в основном используется для измерения количества конкретной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с помощью флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (qPCR). Комбинированная ОТ-ПЦР и КПЦР обычно используются для анализа экспрессии генов и количественной оценки вирусной РНК в исследовательских и клинических условиях.

СОДЕРЖАНИЕ

Номенклатура

Не все авторы, особенно более ранние, используют это соглашение, и читатель должен быть осторожен при переходе по ссылкам. ОТ-ПЦР использовалась для обозначения как ПЦР в реальном времени (qPCR), так и ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

История

С момента своего появления в 1977 году Нозерн-блот широко использовался для количественной оценки РНК, несмотря на его недостатки: (а) метод, требующий больших затрат времени, (б) требующий большого количества РНК для обнаружения, и (в) количественно неточный из-за низкого содержания Содержание РНК. Однако с момента ее изобретения Кэри Муллис в 1983 году ОТ ПЦР с тех пор вытеснила Нозерн-блоттинг как метод выбора для обнаружения и количественной оценки РНК.

Принципы

В ОТ-ПЦР матрицу РНК сначала преобразуют в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы (ОТ). Затем кДНК используют в качестве матрицы для экспоненциальной амплификации с помощью ПЦР. Использование ОТ-ПЦР для обнаружения транскрипта РНК произвело революцию в изучении экспрессии генов следующими важными способами:

Одноэтапная ОТ-ПЦР против двухэтапной ОТ-ПЦР

Конечная ОТ-ПЦР против ОТ-ПЦР в реальном времени

Количественное определение продуктов ОТ-ПЦР в основном можно разделить на две категории: конечная точка и оценка в реальном времени. Использование конечной точки ОТ-ПЦР является предпочтительным для измерения изменений экспрессии генов в небольшом количестве образцов, но ОТ-ПЦР в реальном времени стала золотым стандартом для проверки количественных результатов, полученных в результате анализа массива или изменений экспрессии генов на мировой масштаб.

Конечная ОТ-ПЦР

Относительная ОТ-ПЦР Относительная количественная оценка RT-PCR включает коамплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации можно провести прямое сравнение относительного содержания транскриптов в нескольких образцах мРНК. Следует отметить одну меру предосторожности: внутренний контроль должен выбираться таким образом, чтобы экспериментальное лечение не влияло на него. Уровень экспрессии должен быть постоянным во всех образцах и с учетом интересующей мРНК, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона целевой и контрольной амплификации, крайне важно принять во внимание исходную концентрацию целевых молекул и скорость их амплификации до начала анализа. Результаты анализа выражаются в виде отношения сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, значения которого затем можно использовать для сравнения между образцами при оценке относительной экспрессии целевой РНК. Конкурентная ОТ-ПЦР Для абсолютной количественной оценки используется метод конкурентной ОТ-ПЦР. Он включает использование синтетической «конкурентной» РНК, которую можно отличить от целевой РНК по небольшой разнице в размере или последовательности. Для создания синтетической РНК важно быть идентичной по последовательности, но немного короче целевой РНК для получения точных результатов. После конструирования и синтеза известное количество конкурирующей РНК добавляется к экспериментальным образцам и коамплифицируется с мишенью с помощью ОТ-ПЦР. Затем строят кривую концентрации конкурентной РНК, и ее используют для сравнения сигналов ОТ-ПЦР, полученных от эндогенных транскриптов, для определения количества мишени, присутствующей в образце. Сравнительная ОТ-ПЦР Сравнительная ОТ-ПЦР аналогична конкурентной ОТ-ПЦР в том, что РНК-мишень конкурирует за реагенты для амплификации в рамках одной реакции с внутренним стандартом неродственной последовательности. После завершения реакции результаты сравниваются с кривой внешнего стандарта для определения целевой концентрации РНК. По сравнению с относительными и конкурентными методами количественной оценки сравнительная ОТ-ПЦР считается более удобным методом для использования, поскольку не требует от исследователя проведения пилотного эксперимента; в относительной ОТ-ПЦР должен быть заранее определен диапазон экспоненциальной амплификации мРНК, а при конкурентной ОТ-ПЦР должна быть синтезирована синтетическая конкурирующая РНК.

ОТ-ПЦР в реальном времени

SYBR Зеленый Когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, он будет излучать свет при возбуждении. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, так как создание зондов не требуется из-за отсутствия специфичности их связывания. Однако, поскольку краситель не отличает двухцепочечную ДНК от продуктов ПЦР и от димеров праймеров, переоценка целевой концентрации является обычной проблемой. Если точная количественная оценка является абсолютной необходимостью, необходимо провести дальнейший анализ для подтверждения результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании.

Для количественной оценки результатов, полученных с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, обычно используются две стратегии; метод стандартной кривой и метод сравнительного порога.

заявка

Методы исследования

ОТ-ПЦР обычно используется в исследовательских методах для измерения экспрессии генов. Например, Lin et al. использовали qRT-PCR для измерения экспрессии генов Gal в дрожжевых клетках. Во-первых, Lin et al. сконструировали мутацию белка, предположительно участвующего в регуляции генов Gal. Предполагается, что эта мутация избирательно подавляет экспрессию Gal. Чтобы подтвердить это, уровни экспрессии генов дрожжевых клеток, содержащих эту мутацию, анализировали с помощью qRT-PCR. Исследователи смогли окончательно определить, что мутация этого регуляторного белка снижает экспрессию Gal. Нозерн-блот- анализ используется для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК.

Вставка гена

Диагностика генетических заболеваний

Обнаружение рака

Ученые работают над способами использования ОТ-ПЦР при обнаружении рака, чтобы улучшить прогноз и контролировать реакцию на терапию. Циркулирующие опухолевые клетки продуцируют уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака. Цель состоит в том, чтобы определить, какие транскрипты мРНК служат лучшими биомаркерами для определенного типа раковых клеток, а затем проанализировать уровни их экспрессии с помощью ОТ-ПЦР.

Вызовы

Несмотря на свои основные преимущества, ОТ-ПЦР не лишена недостатков. Экспоненциальный рост обратно транскрибируемой комплементарной ДНК (кДНК) во время нескольких циклов ПЦР приводит к неточному количественному определению конечной точки из-за трудности поддержания линейности. Чтобы обеспечить точное обнаружение и количественную оценку содержания РНК в образце, была разработана qRT-PCR с использованием модификации на основе флуоресценции для мониторинга продуктов амплификации во время каждого цикла PCR. Чрезвычайная чувствительность метода может быть палкой о двух концах, поскольку даже малейшее загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам. Простым методом устранения ложноположительных результатов является включение якорей или меток в 5′-область специфичного для гена праймера. Кроме того, планирование и разработка количественных исследований может быть технически сложной задачей из-за существования многочисленных источников вариаций, включая концентрацию матрицы и эффективность амплификации. В качестве контроля можно использовать добавление известного количества РНК в образец, добавление серии разведений РНК, генерирующих стандартную кривую, и добавление образца без копий матрицы (без кДНК).

Протокол

ОТ-ПЦР может быть проведена с использованием протокола одноэтапной ОТ-ПЦР или двухэтапного протокола ОТ-ПЦР.

Одноэтапная ОТ-ПЦР

Одностадийная ОТ-ПЦР подвергает мишени мРНК (до 6 т.п.н.) обратной транскрипции с последующей амплификацией ПЦР в одной пробирке. Важно отметить, что использование интактной высококачественной РНК и праймера, специфичного для последовательности, даст наилучшие результаты.

(Руководство по применению ПЦР и биологические инструменты)

Двухэтапная ОТ-ПЦР

Двухэтапная ОТ-ПЦР, как следует из названия, происходит в два этапа. Сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одношаговый. Наборы также можно использовать для двухэтапной ОТ-ПЦР. Как и в случае одноэтапной ПЦР, для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную РНК высокого качества. Праймер для двухэтапной ПЦР не обязательно должен быть специфичным для последовательности.

Шаг первый

Сначала объедините матричную РНК, праймер, смесь dNTP и воду, свободную от нуклеаз, в пробирке для ПЦР. Затем добавьте в пробирку для ПЦР ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу. Затем поместите пробирку для ПЦР в термоциклер на один цикл, в котором

происходит отжиг, расширение и инактивация обратной транскриптазы. Наконец, перейдите сразу ко второму этапу, который представляет собой ПЦР, или храните продукт на льду до тех пор, пока не будет проведена ПЦР.

Шаг второй

Правила публикации

Количественный анализ ОТ-ПЦР считается золотым стандартом для измерения количества копий конкретных кДНК-мишеней в образце, но он плохо стандартизован. В результате, несмотря на то, что существует множество публикаций, в которых используется этот метод, многие из них содержат неадекватные экспериментальные детали и используют неподходящий анализ данных, чтобы сделать неправильные выводы. Из-за присущей изменчивости качества любых количественных данных ПЦР не только рецензентам трудно оценивать эти рукописи, но также становится невозможным воспроизвести исследования. Признавая необходимость стандартизации отчетов об условиях эксперимента, международный консорциум академических ученых опубликовал руководство по минимальной информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE, произносится как mykee). В рекомендациях MIQE описывается минимальный объем информации, необходимой для оценки количественных экспериментов ПЦР, которая должна потребоваться для публикации для поощрения лучшей экспериментальной практики и обеспечения актуальности, точности, правильной интерпретации и повторяемости количественных данных ПЦР.

Руководство состоит из следующих элементов: 1) план эксперимента, 2) образец, 3) экстракция нуклеиновой кислоты, 4) обратная транскрипция, 5) информация о мишени кПЦР, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) проверка и 9) данные. анализ. Конкретные элементы в каждом элементе имеют метку E (обязательно) или D (желательно). Те, что помечены E, считаются критическими и незаменимыми, в то время как помеченные D считаются второстепенными, но важными для лучших практик.

Источник

ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

Какие есть недостатки

Показания к проведению ПЦР-анализа

Подготовка к проведению ПЦР-теста

Как проводится ПЦР-анализ

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

Источник

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

Источник

Принцип ПЦР исследования

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…

Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.

Как работает ПЦР?

Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.

Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.

Почему реакция называется полимеразная цепная?

В чём преимущества ПЦР?

Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:

ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:

Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:

Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:

Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:

Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!

Источник