иммунохроматография что это такое
Лабораторные тесты на коронавирус Covid-19 простым языком. Как правильно выбрать метод исследования.
Нас интересуют 2 простых вопроса:
Мы коротко описали основные виды тестов на коронавирус, которые сейчас предлагают клиники и лаборатории. Совсем без специфической терминологии не обойтись, но мы постарались описать их максимально понятно. И что самое ценное, рассказали, какие виды тестов показательны в какой период заболевания, что означают положительные и отрицательные результаты того или иного метода и в каких случаях придется пройти повторное тестирование.
Молекулярная диагностика коронавируса (ПЦР)
Важнейшим лабораторным методом является ПЦР в биоматериале, взятом из дыхательных путей (мазок из носа и ротоглотки).
Суть метода ПЦР заключается в том, что генетическая информация вируса (РНК) многократно копируется в лабораторных условиях специальным прибором – амплификатором, увеличивая свою концентрацию в два раза в каждом цикле копирования. Это дает возможность выявить вирус или бактерию даже в тех случаях, когда его количество составляет лишь сотню клеток в миллилитре крови. Если генетическая информация тестируемой бактерии или вируса в пробе отсутствует, то она не копируется и не определяется.
Анализ методом ПЦР обычно проводится тем, у кого есть симптомы респираторного заболевания или тем, кто имел контакты с возможным источником инфекции.
Отсутствие генетического материала возбудителя (отрицательный результат) означает, что человек не инфицирован на момент взятия анализа. Для подтверждения или исключения наличия инфекции тест выполняется повторно через определенные промежутки времени.
ПЦР-диагностика используется для установления факта заболевания коронавирусом. Вирус можно обнаружить сразу после заражения, даже если у пациента еще нет проявлений болезни. Анализ уместно сделать, если вы контактировали с носителем инфекции или находились там, где было возможно заражение. Он также используется для подтверждения диагноза.
Однако молекулярные РНК-тесты не являются абсолютно надежными и могут у значительной части в действительности инфицированных пациентов дать отрицательный результат. Это зависит от достаточности содержания вируса в материале выбранной локализации на той или иной стадии инфекции, качества взятия материала, предела чувствительности теста, присутствия ингибиторов ПЦР и пр. Поэтому в диагностике особое значение придается характерной картине КТ. В дополнение к этим исследованиям и клинической оценке могут быть полезны исследования, направленные на выявление в крови специфических антител, вырабатываемых организмом против SARS-CoV-2.
Нет, мы не хотим вас запутать. Если тест отрицательный, но симптомы присутствуют, не надо читать статьи, нужно обратиться к врачу. Специфику течения любой инфекции никто не отменял. Врач будет использовать дополнительные методы исследования и ставить диагноз. Не занимайтесь самодиагностикой. Для этого нужно было закончить медицинский ВУЗ.
У нас в клинике вы можете пройти исследование РНК коронавирусов SARS-CoV-2 (COVID-19), SARS-CoV и MERS-CoV методом ПЦР (качественное определение). Тест-система разработана в ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Чувствительность используемой тест-системы составляет 103 копии плазмид на миллилитр (10*3).
Тестирование на наличие антител к коронавирусу COVID-19
Для получения ответа на вопрос инфицирован ли пациент в данный момент, подвергался ли человек воздействию вируса и развился ли у него иммунный ответ, необходимо применение тестов на выявление антител (Ig G, Ig M, Ig A) к конкретному вирусу. В основе таких тестов лежат методы иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографии (ИХА) и их аналогов.
Антитела класса М появляются в острой фазе заболевания и снижаются после выздоровления. Антитела класса G появляются на 7 сутки от начала заболевания и держатся длительное время, продолжительность этого времени еще неизвестна.
По наличию и уровню IgM антител в крови можно судить о текущей или недавно перенесенной инфекции. Антитела IgM появляются уже через несколько дней после первых проявлений болезни (на 2-3 сутки от начала заболевания), их концентрация достигает максимума на 7-10 сутки от начала заболевания и определяются в крови 1- 1,5 месяца. IgM первым вырабатывается среди всех иммуноглобулинов при контакте организма с инфекцией, поэтому их называют иммуноглобулинами первичного иммунного ответа. Их присутствие в крови свидетельствует об острой стадии инфекционного процесса.
Специфические IgG антитела обычно присутствуют в крови длительное время и после выздоровления и могут выполнять защитную роль. Поэтому исследование уровня специфических IgG к SARS-CoV-2 может помочь для прогноза вероятного наличия иммунной защиты в результате перенесенной инфекции. Таким образом, определение IgG не используется при ранней диагностике инфекции – он обнаруживается в крови через две недели от начала заболевания, пик его определяется через месяц и продолжительность определения его пока неизвестна. IgG определяет появление иммунитета в дальнейшем.
Для первичного прохождения исследования на антитела, рекомендуется выявление в крови одновременно IgM и IgG антител.
У нас в клинике вы можете пройти экспресс-тестирование за 15 минут методом ИХА или сдать кровь на анализ на антитела методом ИФА. Мы работаем только с аккредитованными Роспотребнадзором лабораториями.
Экспресс тест на коронавирус (ИХА)
Экспресс тесты проводятся методом иммунохроматографии (ИХА), не требуют использования специального оборудования, но требуют присутствие медсестры, так как забор крови производится из пальца. Продолжительность процедуры анализа находится в пределах 10-30 минут
Положительный результат такого теста требует обязательной проверки методом ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Существует два типа быстрых тестов на COVID-19:
Процедура анализа чрезвычайно проста:
Анализ на антитела к коронавирусу (ИФА)
Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) – полуколичественный анализ, им определяется количество выявленных антител IgM и IgG. Берется венозная кровь, а для исследования используется сыворотка крови.
Показания для назначения анализа на антитела к коронавирусу COVID-19:
В двух словах, чем отличается ИФА и ИХА? В каком случае достаточно эксперсс теста (ИХА), а когда нужно точно делать количественный (ИФА)?
Дополнительные методы диагностики
Кроме указанных выше специфических анализов, у больных коронавирусной инфекцией, и для лиц с подозрением на это заболевание, определяют газы, растворенные в крови, печеночные и почечные пробы, миоглобин, ферменты миокарда, скорость оседания эритроцитов, С-реактивный белок, общий анализ мочи и проводят другие исследования, которые позволяют уточнить состояние пациента и назначить нужное лечение.
Коротко обо всех методах диагностики коронавируса
Тест на коронавирус и антитела к нему – взаимодополняющие диагностики.
Тест на коронавирус- это определение вируса в мазке из ротоглотки методом ПЦР. Он используется для того, чтобы установить наличие коронавируса на самых ранних стадиях, даже если у вас нет никаких симптомов проявлений болезни. Но при этом используется обычно при наличие симптомов, либо при положительном анализе на антитела М.
Анализ на антитела к коронавирусу позволяет выявить как заболевших в острой стадии, так и уже переболевших коронавирусом COVID-19.
Наличие специфических антител класса M (иммуноглобулинов IgM) выявляются в крови в острой фазе заболевания и вскоре после выздоровления снижаются. Наличие специфических антител класса G (иммуноглобулинов IgG) в сыворотке крови говорит о факте инфицирования вирусом SARS-CoV-2 в прошлом и о сформированном специфическом иммунном ответе (наличие иммунитета).
Как понять, болею ли я сейчас и могу ли быть заразен?
Как понять, болел ли я в прошлом и есть ли иммунитет?
Методы исследований и интерпретация результатов
А это самый полезный и заключительный раздел статьи, в котором мы поможем вам разобраться, какие результаты дают разные методы исследований и что они означают.
Для первичного прохождения исследования на антитела, рекомендуется выявление в крови одновременно IgM и IgG антител. Почему? Потому что отдельно результаты по IgM или IgG не всегда могут дать понимание текущей ситуации.
Научная электронная библиотека
Морозова В. С., Габрильянц О. А., Мягкова М. А.,
3.2.4. Иммунохроматографический анализ
К иммунохимическим методам относится также метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых» [17]. Этот метод заслуживает наиболее пристального внимания, т.к. является самым распространенным при выявлении ПАВ и не требует оборудования и специалистов для проведения. Экспресс-тесты используют в химико-токсикологических лабораториях для скрининга, при прохождении медосмотров при устройстве на работу, при тестировании абитуриентов и студентов вузов. Метод может использоваться для тестирования водителей на дорогах, в домашних условиях родителями для контроля детей. Объектами исследования в данном случае являются моча, жидкость ротовой полости, потожировые выделения (редко).
К преимуществам ИХА следует отнести:
● быстроту и легкость в использовании;
● малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;
● дешевизну для производителя и потребителя;
● возможность производства тестов в больших объемах;
● простоту чтения и интерпретации результата;
● высокую чувствительность и вопроизводимость;
● возможность количественного определения;
● возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;
В связи с большим количеством преимуществ по сравнению с другими скрининговыми методами, ИХА получил широкое применение
и находится на первом месте на мировом рынке диагностики. ИХА применяется в различных областях медицины и народного хозяйства:
● банки крови и плазмы;
● промышленность (контроль качества, безопасности, идентификация продукта, эко-контроль);
● сельское хозяйство, агрономия;
Тест-полоски для ИХА являются чрезвычайно удобными и простыми в использовании, однако они имеют сложное строение и процесс разработки каждого вида ИХА является чрезвычайно трудоемким и высокотехнологичным.
ИХА-тест (иммунохроматографическия полоска) состоит из следующих основных элементов: пластиковой подложки, на которую наклеены все остальные компоненты теста, фильтра (прокладки для образца), прокладки или мембраны с конъюгатом, хроматографической мембраны, содержащей одну или несколько зон захвата иммунных комплексов и контрольную зону захвата, мембраны абсорбции (впитывающая прокладка) (рис. 13). Тест-полоска может быть помещена в пластиковый корпус, в котором имеется приемное и тестовые «окна».
Рис. 13. Схематическое изображение иммунохроматографической тест-полоски
Метод ИХА, так же как и ИФА, имеет несколько форматов. Наиболее распространены 2 схемы: прямой (сэндвичный) и непрямой конкурентный метод.
В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат специфических антител с красящей меткой (в случае визуальной оценки результата), нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, на мембране с конъюгатом происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске (рис. 14).
Рис. 14. Схема прямого (сэндвичного) ИХА
Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.
Схема сэндвичного ИХА не подходит для определения низкомолекулярных веществ, т.к. для образования сэндвича Ат-Аг-Ат антиген должен иметь по крайней мере две антигенные детерминанты (т.е. центра связывания с антителами). Кроме того, из-за стерических затруднений образование такого двойного комплекса с низкомолекулярным антигеном маловероятно. Поэтому для анализа небольших молекул, в том числе наркотических веществ, используется другая схема – непрямой конкурентный ИХА.
Метод конкурентого ИХА основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом (рис. 15). Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.
При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа (рис. 15). Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.
Схема оценки результатов ИХА наркотических веществ представлена на рис. 16. Результат теста является недействительным при отсутствии контрольной линии, т.к. этот факт может свидетельствовать о незавершенной процедуре анализа, либо о том, что иммунохимическая реакция не прошла должным образом по какой-либо причине (из-за испортившихся иммунореагентов или несоблюдения инструкции по применению теста).
Рис. 15. Схема конкурентного ИХА
Рис. 16. Схема оценки результатов ИХА метаболитов наркотических веществ
Часто, особенно в случаях когда недоступны большие количества биообразца для анализа, например, для определения наркотических веществ в слюне, используются тест-полоски в пластиковой кас-
сете (рис. 17).
Рис. 17. Пластиковый корпус иммунохроматографического теста
В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:
1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное рефлектометрическое определение (например, сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мильтианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота, которые образуют линии темно-бурого (или темно-розового) цвета.
2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.
3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.
4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.
5) Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.) [17].
Разработка технологических стадий иммунохроматографического анализа является наукоемким, высокотехнологичным и многостадийным процессом: он включает в себя подбор материалов, реагентов и условий проведения анализа на нескольких этапах разработки ИХА. Перечислим основные этапы разработки:
● выбор материалов для производства тест-полосок;
● подбор оптимальных концентраций иммунореагентов: конъюгатов Ат-метка, конъюгатов антиген-белок-носитель, антивидовых антител;
● подбор дополнительных реагентов для предобработки компонентов тест-полоски (позволяет улучшить свойства потока, и тем самым обеспечить лучшую чувствительность теста);
● подбор реагентов и их концентраций для «забивки» мембраны, если это необходимо (позволяет улучшить характеристики анализа и стабильность теста);
● оптимизация условий проведения анализа реальных образцов;
● изучение стабильности тест-системы, выбор условий хранения и упаковки для увеличения срока хранения тестов.
На рис. 18 представлена схема производства иммунохроматографических тестов. На каждом этапе данной технологической схемы должна быть произведен выбор материалов и реагентов, оптимизация условий проведения технологической стадии.
Все компоненты тест-полоски (фильтр, мембрана с конъюгатом, хроматографическая мембрана, мембрана абсорбции, см. рис. 13) приклеиваются на пластиковую подложку. Подложка – это лист, состоящий из пластика и имеющий клейкое покрытие. При выборе подложки необходимо обращать внимание на качество клея (это может напрямую влиять на характеристики хроматографической мембраны, которая будет приклеена на подложку) и удобство покрывающей пленки (что обеспечивает точность приклеивания компонентов полоски на подложку).
При выборе материала фильтра для образца необходимо руководствоваться теми функциями, которые должен выполнять фильтр:
● впитать достаточное количество образца и доставить его в мембрану для конъюгата;
● довести рН образца до оптимального;
● увеличить или уменьшить вязкость образца для достижения оптимальной скорости прохождения образца по хроматографической мембране;
● увеличить способность образца растворить конъюгат;
● уменьшить забивку мембраны за счет добавления забивки в прокладку для образца.
Рис. 18. Схема стадий производства иммунохроматографических тестов
Фильтры выпускаются из различных пористых материалов: целлюлозы, стекловолокна, тканных сит. Мембраны для конъюгатов производят из стекловолокна, целлюлозы, поверхностно модифицированного полиэфира или искусственных волокон. Подложка для конъюгата должна обладать высокой адсорбционной способностью с одной стороны, и легкостью «смывания» конъюгата из данной зоны, с другой. Т.е. при прохождении жидкости конъюгат должен хорошо десорбироваться из мембраны. При этом при сушке мембраны после нанесения раствора конъюгата не должно происходить изменение конформации антител и разрушения структуры конъюгата.
Хроматографическая мембрана – самый важный элемент иммунохроматографической полоски. Именно на ней проходит иммунохимическая реакция, происходит разделение и связывание иммунореагентов в тестовой и контрольной зонах. Мембрана является самой длинной зоной тест-полоски, именно здесь иммунореагенты проходят максимальный путь в латеральном потоке. При выборе материала для хроматографической мембраны необходимо руководствоваться следующими свойствами, которыми должна обладать мембрана:
1. Гидрофильность – необходима для возможности прохождения потока (а это водная среда) через мембрану. Обеспечивается выбором материала, а также использованием ПАВ.
2. Способность связывать белки: для формирования тестовой и контрольной линии на мембране необходимо закрепить белковые конъюгаты таким образом, чтобы они не смылись латеральным потоком. Белки «прикрепляются» к мембране с помощью электростатического взаимодействия: диполи, содержащиеся в нитроцеллюлозе, связывают диполи белков (рис. 19).
Рис. 19. Диполи нитроцеллюлозы и белков
Для лучшего закрепления белков на мембране после нанесения растворов конъюгатов и антител на мембрану используют «забивку» или блокировку мембраны: ее обрабатывают раствором инертного белка, чтобы занять все вакантные поры, в которые могли бы мигрировать молекулы белковых конъюгатов и антител, находящихся на контрольной и тестовой линиях. Кроме того, в растворах белков необходимо использовать буфер с нужной кислотностью, чтобы обеспечить максимальное электростатическое взаимодействие диполей нитроцеллюлозы и белков.
При производстве мембран для ИХА используются следующие материалы: нитроцеллюлоза (наиболее распространенный материал, используется в 99 % выпускаемых тест-полосок); нейлон; поливинилиденфторид; полиэфирсульфон; стекловолокно.
При выборе материала мембраны необходимо руководствоваться следующими ее физическими параметрами, которые характеризуют свойства латерального потока, проходящего через данную мембрану:
● толщина мембраны, ее объем слоя;
● пористость, размер и распределение пор;
● номинальная скорость потока;
● прочность (предел прочности на разрыв);
● качество поверхности: неровности, порошок и пыль, оставшиеся на поверхности после производства материала.
Все перечисленные характеристики формируют в конечном итоге главный параметр иммунохроматографической мембраны – скорость латерального потока, определяющий все основные параметры ИХА (рис. 20).
Рис. 20. Влияние скорости потока на характеристики анализа
Все вышеописанные подробности приведены для того, чтобы дать представление о сложности процесса разработки и производства на первый взгляд простых тест-полосок. Для того чтобы получить действительно работающий качественный тест, необходимо очень тщательно пройти все стадии разработки и наладки производства. К сожалению, не все нынешние производители это делают на должном уровне, экономя средства для достижения минимальных цен на рынке. В результате мы имеем общепринятое мнение о неточности ИХА тестов. В то же время качественный ИХА тест может иметь характеристики не хуже, чем тест-система для приборного метода ИФА [17].
Современные материалы и возможности тщательного подбора условий при производстве ИХА тестов позволяют разработать даже количественные варианты ИХА. В этом случае детекция результата осуществляется с помощью специальных считывающих устройств – ридеров для ИХА. В зависимости от типа метки, данные устройства осуществляют различные способы детекции: рефрактометрический, флуоресцентный, магнитный (рис. 21).
Рис. 21. Считывающие устройства для детекции результатов ИХА
Рис. 22. Автоматическая платформа для производства ИХА полосок
Количественный формат ИХА характеризуется гораздо большими требованиями к качеству тест-полосок, и, следовательно, к контролю качества каждой стадии производства тестов. Кроме качества материалов и реагентов, на каждой стадии производства необходимо четко, с высокой точностью, контролировать температуру, влажность, концентрацию реагентов, скорость подачи материалов, давления прессов и т.д. Только в этом случае можно получить количественный ИХА тест. Столь высокие требования возможно выполнить только с использованием специальных закрытых, полностью автоматизированных платформ, в которых каждый из параметров контролируется и поддерживается с высокой точностью (рис. 22).